SOX4基因表达特征的泛癌分析*

李子木，闫 虹，董囡囡，康媛媛

(1.中国人民解放军北部战区总医院口腔内科,沈阳 110013；2.中国医科大学口腔医学院急诊黏膜科，沈阳 110001)

SRY-related HMG-box(SOX)作为一类常见的转录因子家族，参与调控胚胎的发育和分化、神经系统的形成和血管发育等过程[1-2]。SOX4是SOX家族C亚族的重要成员之一，定位于人类Y染色体6p22.3,编码蛋白质的相对分子质量为47×103[3-4]。研究表明，SOX4在多种肿瘤中存在异常表达，并与肿瘤患者的预后密切关联[5-6]。VERVOORT等[7]研究报道，SOX4在肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌、肝癌及胰肠癌中均高表达。沉默SOX4基因可以抑制黑色素瘤和其他肿瘤细胞的增殖和转移能力[8-9]。在乳腺癌中，SOX4能够促进上皮间充质化的过程[2]；但在胶质瘤细胞系中，SOX4通过激活p53-p21信号通路和下调磷酸化Akt1，发挥抑癌作用[10]。异常表达的SOX4在不同类型的恶性肿瘤中会对肿瘤生物学行为产生不同的影响。尽管基于细胞试验或动物研究的证据支持SOX4与肿瘤之间的联系，但目前罕见关于SOX4泛癌研究的报道。因此，本研究通过分析癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合数据库(GEO)，揭示SOX4基因在各种肿瘤中的表达情况，与疾病的预后作相关性分析，并在3种常见肿瘤细胞中进行验证，进一步阐明SOX4基因的突变情况及与免疫浸润的关系。本研究有助于深入了解SOX4异常表达的病因及其调控机制，为SOX4的靶向治疗提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

TCGA(http://can-cergenome.nil.gov)数据库收集了肿瘤患者临床的基本信息，包括基本资料、临床分期、病理分期和生存情况等。下载肿瘤mRNA-seq数据及临床相关数据。乳腺癌细胞(MCF-7)、乳腺上皮细胞(MCF-10A)、口腔鳞状细胞癌细胞(SCC-4)、人类永生化表皮细胞(HaCat)、人非小细胞肺癌细胞(A549)、人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)均购于中国科学院上海细胞库。DMEM培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司，1640培养基购于美国Corning公司。Trizol购于美国Gibco公司,逆转录试剂盒和定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒均购于日本TaKaRa公司,引物由上海吉玛生物有限公司设计并合成，BCA试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司,SOX4单克隆抗体、单克隆抗体均购于英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1基因表达

利用TIMER2(http://timer.cistrome.org)工具，采用Exploration部分的Gene_DE模块，挖掘TCGA数据库中SOX4在肿瘤组织中的表达情况。利用GEPIA2中“Expression DIY”部分的“Stage Plot”模块进一步探索SOX4的表达与肿瘤临床病理分期之间的相关性，SOX4的表达水平采用Log2(TPM+1)量表表示；利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)网站中“CPTAC analysis”模块，挖掘TCGA数据库中SOX4蛋白表达的水平。

1.2.2细胞培养

MCF-7、MCF-10A、SCC-4、HaCat接种于6孔板，在含有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM混合培养基中，置于5%CO2、37 ℃的加湿细胞培养箱中常规培养。A549、BEAS-2B接种于6孔板中，在含有10%胎牛血清、1%青链霉素的1640混合培养基中，置于5%CO2、37 ℃的加湿细胞培养箱中常规培养。培养基每3天换液1次。

1.2.3定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

收集6种细胞，利用Trizol试剂提取细胞RNA，通过逆转录，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为对照，进行qPCR扩增。逆转录体系如下：5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL，RNA 1 μg,RNase Free dH2O添加至20 μL。逆转录条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，4 ℃进行保存。PCR体系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus，2×)10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX染料 0.2 μL，cDNA溶液 2 μL，RNase Free dH2O添加至20 μL。SOX4：上游引物CACTCCTCCTCTTCCTCCTC，下游引物GCCGACGAC GAACTGAAG。GAPDH：上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC。PCR条件如下：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，共40个循环，60 ℃，1 min；95 ℃，0.15 s。以2-ΔΔCT表示相对定量结果，应用Graphpad prism 5软件对RT-qPCR结果进行分析。

1.2.4蛋白质印迹法(Western blotting)

收集6种细胞，利用BCA试剂盒提取细胞蛋白。经10%十二烷基硫酸钠(SDS)、5%聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳后进行转膜。5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入鼠抗人SOX4单克隆抗体4 ℃过夜。加入二抗兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)37 ℃下孵育1 h，碱性磷酸酶显色，增强化学发光(ECL)，扫描并拍照。采用凝胶成像分析软件对结果进行半定量分析。

1.2.5生存分析

利用GEPIA2网站“Survival Analysis”模块获取TCGA数据库中不同SOX4对肿瘤患者总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的影响，结果以单基因生存分析图表示(Kaplan-Meier曲线)。设定“临界值-高(50%)”“临界值-低(50%)”作为拆分高表达组和低表达组的表达阈值，探索SOX4与肿瘤患者生存因素之间的表达模式。

1.2.6基因突变分析

通过cBioPortal网站(https://www.cbioportal.org)“Query”部分选择TCGA泛癌图谱分析，挖掘SOX4在TCGA数据库中的变异情况，包括突变频率、突变类型和拷贝数变化。点击“Mutation”模块，显示SOX4基因突变位点信息。

1.2.7免疫浸润分析

利用TIMER2工具“Immune”模块挖掘TCGA数据库肿瘤中SOX4的表达与免疫浸润之间的相关性。选择Treg、单核细胞、内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞(CAF)为研究对象，应用QUANTISEQ、CIBERSORT、MCPCOUNTER、XCELL等不同算法进行免疫浸润评估。

1.2.8富集分析

一种价值观要真正发挥作用，必须融入社会生活，与社会生活紧密联系起来，让人们在实践中感知它、领悟它，增强认同感和归属感。志愿服务活动，是人人可为、人人能为的重要载体，有利于增强社会主义核心价值观的吸引力、感染力，提高人们对主流价值观的认同感。

利用STRING(https://string-db.org)数据库筛选出50个有实验验证、与SOX4相结合的蛋白。本研究中输入“SOX4”，物种选择“人类”，证据类型选择“experiments”，置信度选择“low confidence(0.150)”，最大数相互作用选择“50”。利用GEPIA2数据库“Expression Analysis”部分的“Similar Genes Detection”模块筛选前100个与SOX4相关靶向基因，利用Jvenn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)网站对50个SOX4结合蛋白、前100个与SOX4相关靶向基因进行交叉分析。此外，DAVID网站(https://david.ncifcrf.gov)和“ggplot2”(https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html)R软件包用于KEGG通路分析。

1.3 统计学处理

采用R4.0.3统计软件进行分析。采用Wilcoxon秩和检验进行两组间比较，两组以上比较使用Kruskal-Wallis秩和检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。采用Pearson相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因和蛋白表达情况

与正常组织比较，SOX4在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸润癌(BRCA)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形性胶质细胞瘤(GBM)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、肝细胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、胃癌(STAD)、甲状腺癌(THCA)和子宫内膜癌(UCEC)中的表达明显升高，而在肾透明细胞癌(KIRC)、肾嫌色细胞癌(KICH)组织中的表达明显降低，见图1。CPTAC数据库分析结果显示，SOX4蛋白在乳腺癌、UCEC和LUAD中的表达水平明显升高，见图2。利用GEPIA2数据库，分析不同肿瘤组织中SOX4蛋白表达水平与肿瘤患者临床病理分期之间的相关性，发现SOX4蛋白表达与ESCA、LIHC、胰腺癌(PAAD)、皮肤黑色素瘤(SKCM)和THCA的病理分期密切相关，见图3。RT-qPCR和Western blotting结果见图4，3种肿瘤细胞中SOX4 mRNA和SOX4蛋白表达水平均上调(P<0.05)，这与网站中获得的结论一致。

**:P<0.01；***:P<0.001,与正常组织比较。

***:P<0.001,与正常组织比较。

图3 SOX4的表达与不同肿瘤临床分期之间的关系

A：RT-qPCR结果；B：Western blotting结果；**：P<0.01。

2.2 生存分析

SOX4高表达与LIHC患者OS预后不良明显相关(P=0.007 3),而SOX4低表达与KIRC、脑低级别胶质瘤(LGG)、胸腺癌(THYM)患者OS预后不良明显相关(P<0.05)，见图5A。DFS数据分析结果显示，SOX4高表达与ESCA、PAAD患者不良预后相关(P<0.05),而SOX4低表达与UCEC患者不良预后相关(P<0.05)，见图5B。

A：不同肿瘤的OS；B：不同肿瘤的DFS。

2.3 基因突变分析

以SOX4扩增为主要变异类型的BLCA患者SOX4基因突变频率最高(>15%)。在所有的卵巢浆液性囊腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、葡萄膜黑色素瘤、CHOL和LIHC患者中，绝大多数均为SOX4拷贝数扩增，见图6。图7进一步显示，SOX4遗传变异的类型、位点和病例数。SOX4错义突变是主要的遗传变异类型，在1例SKCM和1例COAD患者中检测到E111K/Q的改变。

图6 SOX4在肿瘤中的变异类型

图7 SOX4变异突变位点的变化频率

2.4 免疫浸润分析

研究TCGA数据库中肿瘤免疫细胞的浸润水平与SOX4基因表达之间的关联，发现在HNSC、HNSC-HPV-和THCA中，Treg细胞的免疫浸润与SOX4表达之间呈正相关。SOX4的表达与SARC中单核细胞的浸润呈负相关。在CESC、COAD、HNSC、HNSC-HPV-、KIRC、LUSC和SKCM中，SOX4与内皮细胞的浸润呈正相关。同样，在CESC、COAD、ESCA、HNSC、HNSC-HPV-、KIRC、LUSC、READ和STAD中，SOX4表达与CAF之间呈正相关，但与TGCA中CAF的浸润呈负相关。见图8。

图8 SOX4表达与免疫细胞浸润的相关性

2.5 富集分析

图9 交叉分析结果

图10 SOX4相关基因KEGG通路分析

3 讨 论

SOX家族是一个庞大且功能广泛的转录因子家族，包含至少20个成员，该家族成员的产物都具有一个HMG基序保守区[11-12]。SOX4是SOX家族的重要成员之一，现有研究证明SOX4基因可调节细胞信号通路，影响细胞增殖、分化和凋亡等过程，并通过转录调节促进或抑制肿瘤的生长[13]。通过文献检索，作者发现罕有研究从整体肿瘤角度对SOX4进行泛癌分析。因此，本研究基于公共数据库，从基因表达、变异和功能机制等方面对不同肿瘤中的SOX4进行了全面挖掘和分析。

本研究首先探讨了TCGA数据库中SOX4基因的表达情况和对患者预后的影响。在LGG和THYM患者中，SOX4呈高表达，但生存分析结果显示，SOX4高表达的患者预后良好。分析两者结果不一致的原因可能有：(1)SOX4高表达或低表达组的患者数量较少，可能需要更大的样本量来验证上述结论；(2)需要更深入的分子实验证据来确定SOX4的高表达在上述肿瘤的发生中起重要作用，否则其可能仅仅是正常组织中抵抗肿瘤变化的结果。此外，为进一步验证SOX4在肿瘤中的致病作用，作者收集了SCC-4、MCF-7及A549，与对照细胞进行比较。在体外分别从mRNA和蛋白水平检测了SOX4的变化，发现mRNA和蛋白表达水平均明显升高，这与数据库的结果相一致。

由于SOX4在多种肿瘤中的表达存在明显异常，本研究深入探讨了其变异特征，发现扩增是最常见的变异类型。通过软件筛选前50个有实验验证的相关蛋白，发现Mex3A、HDAC2、ZNF669、ILF2、KHDRBS1和ZNF260与SOX4相关。尽管上述蛋白在肿瘤致病中的不同作用已被报道，但其对肿瘤的确切致病机制尚不清楚，这也是未来研究的重点。

肿瘤浸润性免疫细胞是复杂肿瘤微环境的重要组成部分。依据细胞类型，其可能调节肿瘤的致病过程[14]。Treg是维持机体免疫耐受的重要因素之一。早期的研究显示，在各种共刺激和共抑制受体的作用下，Treg在免疫稳态、自身免疫和抗肿瘤免疫中发挥重要作用[15]。不同的单核细胞在分泌抑瘤介质、促进血管生成、重塑细胞外基质、募集淋巴细胞及分化为肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞等方面实现了促瘤和抗瘤免疫功能[16]。CAF可通过多种机制促进肿瘤进展，包括可溶性因子和细胞外基质的分泌，血管生成、免疫和代谢的调节[17]。本研究发现，在某些特定肿瘤中，SOX4表达与Treg、单核细胞、内皮细胞和CAF之间存在紧密关联。此外，作者对所有的SOX4靶向结合蛋白和SOX4蛋白表达相关基因进行了富集分析，发现SOX4与“病毒致癌”密切相关。SOX4可通过一系列正反馈机制促进病毒的复制，从而影响肿瘤的进程[18]。研究表明，SOX4与“肿瘤MicroRNA”也存在相关性，例如miRNA-214-5p通过靶向SOX4抑制PRAD细胞的增殖[19]，miRNA-212通过靶向SOX4在大肠癌中发挥抑癌作用[20]，miRNA-34a-5p通过靶向SOX4调节Wnt/β-连环蛋白信号通路进而调节神经母细胞瘤的进展[21]。

综上所述，SOX4的泛癌分析表明，多个肿瘤中的SOX4存在表达异常，SOX4与患者的临床预后、基因突变、免疫细胞浸润等均有相关性。本研究结果为了解SOX4的功能提供了初步依据，但其具体的生物学作用和机制还需要进一步的实验验证。