液体活检在肺癌诊疗中的研究进展*

李如清，王 平 综述，傅雨绮，黄新恩 审校

(南京医科大学附属肿瘤医院/江苏省肿瘤医院/江苏省肿瘤防治研究所，南京 210009)

最新数据表明，肺癌全球发病率为11.4%，致死率为18.0%，已成为恶性肿瘤致死的首要原因[1]。目前，早期发现和诊断肺癌主要依靠传统肿瘤标志物、低剂量计算机断层扫描(CT)扫描和组织活检。然而，传统肿瘤标志物、影像学在诊断准确性和敏感性方面欠佳[2]。而组织活检虽然是肺癌诊断的“金标准”，但是仍具有缺点，如活检取样的可及性、活检组织不足、存在活检并发症、肿瘤异质性导致的生物标志物检测结果不可靠等[3]。因此，需要寻找一种可靠的方法来辅助筛查和诊断早期肺癌。近年来，液体活检逐渐兴起。本文综述了液体活检主要检测对象，及其在肺癌筛查和早期诊断、预测治疗敏感性和耐药性、评价治疗效果、预测预后和在肿瘤残余病灶中的潜在临床应用价值，以及临床常规实施前仍需克服的障碍。

1 液体活检

液体活检是指通过分子生物学的方法，对外周血或其他体液中的多种癌症来源成分进行检测分析，从而获取肿瘤相关信息。液体活检的检测对象主要是循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环游离DNA(cfDNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、外泌体等。液体活检的主要缺点是样本中生物标志物数量少[4]。因此，需要高敏感度的检测技术。当前，液体活检的检测技术主要为聚合酶链反应(PCR)、数字PCR(dPCR)和子代测序(NGS)。PCR针对一个预定义基因中的1～3个位点，无法跨多个基因进行复合，也无法检测更复杂的基因组改变，如融合基因。dPCR是一种可以在单分子水平上识别和量化不同突变的新方法，已经开发了不同的平台类型，包括固体、珠状、乳化、扩增和磁性PCR等。而NGS是一种高通量测序方法，可以同时检测基因组的可变区域和体细胞突变，包括单核苷酸变异、拷贝数变异、基因融合等[4-5]。随着检测技术的逐渐成熟，液体活检正在被用于肺癌的各个阶段，包括筛查及早期诊断肿瘤、预测治疗敏感度和耐药性、评价治疗效果、预测预后、监测残余病灶等[6]。

2 液体活检主要检测对象

2.1 CTCs

CTCs是指原发灶或转移灶脱落进入外周血的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞可能经历了上皮间质转化，有更强的侵袭性，易发生远处转移。CTCs富集和分析方法基于其物理和生物学特性，如大小、密度、极性、电荷、上皮细胞黏附分子和细胞角蛋白的表达、白细胞特异标志物CD45的表达等[7]。目前富集和分析CTCs的方法包括CellSearch、基于形态学富集的膜过滤技术(ISET)和上皮细胞免疫斑点技术(EPISPOT)等[8]。国家药品监督管理局已审批通过首个专门针对非小细胞肺癌(NSCLC)CTCs检测的试剂盒：叶酸阳性富集试剂盒。有学者认为，CTCs的表型特征可用于基因表达谱的分析，例如研究肿瘤异质性或识别特定的靶基因改变，以及评估治疗相关标志物(免疫治疗的程序性细胞死亡配体1)[9]。CTCs检测在肺癌患者的诊治及预后等方面发挥着重要作用，进一步研究其特征和性质具有重要价值。

2.2 ctDNA

ctDNA是指人体血液循环系统中具有肿瘤相关特征(包括单核苷酸突变、拷贝数异常和甲基化等)、来自肿瘤基因组的DNA片段。目前，dPCR技术及突变阻滞扩增系统PCR(ARMS-PCR)技术可用于检测已知突变的ctDNA，而标记扩增深度测序(TAm-Seq)技术和癌症个体化深度测序分析(CAPPSeq)技术可用于检测突变位点未知的ctDNA[10]。尽管可以通过多种不同的液体活检对象获得癌症相关基因信息，但ctDNA是目前唯一被正式批准用于NSCLC患者临床的样本来源，用于EGFR突变检测[4，11]。ctDNA有望在众多临床应用中发挥作用，包括早期癌症筛查、对癌症进行基因分型、检测微小残留病灶、监测治疗反应和分析耐药性等[12]。ctDNA作为一种高效益、高敏感度的工具，具有潜在临床应用价值。

2.3 外泌体

外泌体是一种直径为50～150 nm的膜结合颗粒，可以从血浆、尿液、支气管肺泡灌洗液、腹腔积液等多种体液中检测到。外泌体表面表达多种蛋白质，并包含核酸和脂质在内的多种生物活性物质。这些物质参与了外泌体的抗原提呈、膜转运和融合等过程。外泌体具有良好的稳定性、生物相容性、生物屏障通透性、长血循环能力、低毒性、低免疫原性等优点，可以促进细胞增殖和转移，影响血管生成，在肺癌发生过程中调节抗肿瘤免疫反应，调节肺癌治疗中的耐药性，被认为是肺癌液体活检的重要组成部分。此外，通过工程化外泌体输送治疗药物是肺癌精确和个性化治疗的一种新方法[13-14]。

2.4 lncRNA

lncRNA是长度>200个核苷酸且不具有蛋白质编码功能的转录产物。根据lncRNA编码序列与蛋白质编码基因的相对位置，可分为以下5类：正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA、基因间lncRNA。lncRNA具有以下特点：(1)具有信使RNA相似结构，经过剪切也具有启动子和多聚腺苷酸尾的结构；(2)具有较强的组织和细胞特异性，较低的序列保守性；(3)组织分化过程中具有明显的时空表达特性；(4)在肿瘤与其他疾病中有特征性表达方式[15]。lncRNA可以在转录、转录后和翻译水平起作用，可能参与多种生物学过程，例如DNA损伤修复、细胞存活、细胞信号转导、细胞生长和分化等[16]。由于lncRNA的这些特性，其被认为与癌症的关系紧密。

3 液体活检在肺癌诊疗中的临床应用

3.1 早期筛查和诊断

JIANG等[16]分析了61例肺癌组患者和57例健康对照组全血中lncRNA XLOC-009167的相对表达水平，发现肺癌组lncRNA XLOC-009167表达高于健康对照组(P<0.000 1)；与健康对照组比较，肺癌组lncRNA XLOC-009167的曲线下面积(AUC)为0.739 8(敏感度为78.7%，特异度为61.8%)，传统生物标志物细胞角蛋白19片段抗原(CYFR21-1)、癌胚抗原72-4(CA72-4)和特异性神经元烯醇酶(NSE)的AUC分别为0.518 7(敏感度为32.0%，特异度为86.6%)、0.505 6(敏感度为76.0%，特异度为40.0%)、0.570 7(敏感度为66.0%，特异度为56.6%)。结合3种传统肿瘤标志物采用logistic回归模型建立的联合诊断模型，AUC为0.551 9(敏感度为44.4%，特异度为55.3%)，说明lncRNA XLOC-009167的诊断性能明显优于联合诊断模型和单个传统生物标志物。研究人员还发现，lncRNA XLOC-009167的相对表达量在不同培养时间轴、不同温度下比较均无差异，具有较强的稳定性。因此，lncRNA XLOC-009167可能成为一种新的肺癌诊断标志物。MARQUETTE等[17]利用ISET检测614例慢性阻塞性肺气肿患者血液标本中的CTCs，发现CTCs检测对肺癌的敏感度为26.3%，其中19例参与者在T0时被诊断为肺癌，表明CTCs检测可以先于影像学发现早期肺癌的存在。PENG等[18]对192例可手术的肺部占位性疾病患者行组织活检与血浆ctDNA检测，发现血浆ctDNA检测肺癌的敏感度为69%，特异度为96%。而当ctDNA与传统肿瘤标志物联合检测时，敏感度和特异度分别提高到80%和99%，其中64%的癌症患者处于Ⅰ期，敏感度为63%。这些研究证实了检测ctDNA有助于筛查和诊断早期肺癌。外泌体的各种生物成分(如miRNA、蛋白质等)在肺癌中存在异常表达，具有作为肺癌诊断标志物的潜力。研究人员发现，从NSCLC患者血浆中分离的外泌体平均蛋白水平明显高于健康对照组[(11.1±3.8)mg/mLvs.(8.2±2.0)mg/mL，P<0.001]，NSCLC患者外泌体-T、外泌体-G的中位水平明显高于健康对照组[(27.2±21.1)pg/mLvs.(14.9±5.4)pg/mL、(1.5±0.7)ng/mLvs.(0.9±0.3)ng/mL；P<0.01]，说明外泌体可以用于肺癌的早期诊断[19]。作者推测,液体活检与传统肿瘤标志物、影像学等检查联合将提高肺癌早期诊断的敏感度和特异度。

3.2 预测治疗敏感度和耐药性

有研究人员从小细胞肺癌(SCLC)患者化疗前采集的7.5mL血液分离出CTCs，并对单个细胞的DNA进行NGS，生成全基因组拷贝数图谱，对全基因组拷贝数改变(CNA)数据的生物信息学分析开发出分类器，该分类器包含2 281个聚集在16个CNA图谱内的位点，能正确预测约83%患者的化疗敏感度临床结果。可见，CTCs可用于治疗前化疗敏感度的预测[20]。当前，免疫检查点抑制剂已成为多种癌症的标准疗法。在一项前瞻性研究中，包括NSCLC在内的癌症患者在抗PD-1免疫治疗8周后，检测到ctDNA与明显缩短的中位生存期(PFS)和总生存期(OS)相关(P<0.004)，这为免疫治疗开始前评估ctDNA提供了理论依据[21]。MOHRMANN等[22]发现，41例肺癌患者肿瘤组织中存在BRAF、KRAS、EGFR突变，通过NGS，同样可在95%的血浆外泌体NA样本中检测到，且外泌体NA的NGS检测存在任何肿瘤已有的突变。这说明可以利用外泌体NA检测肺癌中的常见突变，为靶向治疗提供指导。癌症治疗时面临的主要挑战是耐药性。研究人员发现，在NSCLC患者中，携带T790M突变的EGFR-TKI耐药细胞H1975可以通过释放外泌体miRNA-522-3p，激活PI3K/AKT途径，将耐药特性传递给EGFR-TKI敏感细胞PC9，促进其对吉非替尼等的耐药[23]。HUANG等[24]发现FP方案治疗NSCLC患者的组织和细胞中lncRNA AFAP1-AS1过表达,通过竞争性抑制靶点miR-139-5P，上调miR-139-5P靶点RRM2，激活EGFR/AKT通路，以增强NSCLC细胞增殖和化疗耐药。因此，了解lncRNA、外泌体等在肺癌药物治疗过程中在产生耐药方面发挥的作用，有助于辅助肺癌的治疗。

3.3 评价疗效

ABBOSH等[25]发现，在14例确诊的NSCLC复发患者中，有13例(93%)在临床复发前或临床复发时通过ctDNA检测到≥2个单核苷酸变异，在影像学诊断肿瘤复发前7 d检测出NSCLC复发。最近，研究人员使用Clariom D人类芯片技术，在NSCLC患者的样本中，发现3种lncRNAs(SCARNA7、MALAT1和NONHSAT017369)与EGFR突变明显相关(阳性预测值和阴性预测值均大于80%)。32例EGFR-TKI治疗后影像学评估达到部分缓解(PR)和疾病稳定(SD)的患者中，27例显示血浆MALAT1水平下降(P<0.05)，23例显示SCARNA7水平降低(P<0.05),疾病进展(PD)患者中没有观察到类似的趋势。研究表明，检测EGFR-TKI治疗前、后血浆中SCARNA7和MALAT1的水平变化，对EGFR-TKI的疗效有较高的预测价值[26]。有研究人员收集了5例PR和4例PD患者，发现在晚期NSCLC中共120个外泌体miRNA与健康个体存在差异(P<0.05)，肺癌组miRNA320家族中3个miRNA(miRNA-320b、miRNA-320c、miRNA-320d)上调。此外，通过比较PR组治疗前、后miRNA谱变化，找到311个差异表达miRNA(111个上调和200个下调)，尤其是下调的miR-25b-5p(P<0.05)。因此，miR-320家族和miR-25b-5p可作为免疫治疗疗效的预测标志物[27]，提示液体活检可以用于肺癌疗效的评价。

3.4 预测预后

一项回顾性生存分析纳入了347例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者，发现术前CTCs水平是NSCLC患者的独立预后因素(HR=5.489，P<0.001)。以术前CTCs水平为基础，基于多变量COX回归模型的nomogram数据一致性指数为0.82，显示CTCs在NSCLC复发转移的预测方面具有较高价值[28]。郑志刚等[29]发现，lncRNA MEG3在92例SCLC组织中的表达(2.071±0.97)明显低于40例癌旁组织(4.082±0.860)和50例正常肺组织(4.209±0.820)，差异有统计学意义(P<0.001);lncRNA MEG3低表达者较高表达者差异有统计学意义(中位PFS 8个月vs.21个月，中位OS 32个月vs.21个月，P<0.001)。由此，lncRNA MEG3可作为潜在的CLC预后评估标志物。MOHRMANN等[22]还发现，低外泌体NA突变等位基因频率(MAF)患者有更长的中位PFS(11.8个月vs.5.9个月，P=0.006)和治疗失败时间(7.4个月vs.2.3个月，P=0.009)，与PR和SD达6个月相关(P=0.006)，这些数据说明低外泌体NA是延长生存的独立预后因素。与癌旁组织比较，NSCLC癌组织中miR217表达降低，E2F3 mRNA表达升高(P<0.005)；miR217高表达、E2F3 mRNA低表达的患者术后5年OS均高于miR217低表达、E2F3 mRNA高表达患者(P<0.005)。E2F3 mRNA高表达(HR=1.440,95%CI=1.129～2.503)是NSCLC患者预后不良独立危险因素，miR217高表达(HR=0.715,95%CI=0.425～0.902)是独立保护因素(P<0.005)[30]。由此认为，临床可以通过液体活检来预测患者的预后。

3.5 在微小残留病灶(MRD)中的作用

癌症患者接受治疗后，即使影像学上显示病灶彻底清除，仍可能有极少量未被检测到的残存的肿瘤病灶。MRD的激活促进了肿瘤复发与转移。目前，针对MRD的检测主要依靠液体活检。WALDECK等[31]利用NGS检测术后12周采集的16份血浆样本，发现4例ctDNA阳性患者均(100%)经历了后期疾病复发，12例阴性患者中有9例(67%)在随访期间无疾病复发。MRD检测能够对NSCLC复发风险进行有效分层，并对患者术后12～15个月的复发状态进行准确预测[32]。MRD阴性与有利的PFS(HR=0.094,95%CI为0.01～0.061,P=0.013)和OS明显相关(HR=0.03，95%CI为0.002～0.311,P=0.004)[32]。2016年SACHER等[33]发现导致NSCLC产生的两种关键基因：EGFR和KRAS。通过MRD对EGFR或KRAS突变进行监测，能够指导EGFR靶向治疗的停用药时机，以避免新突变的产生，进而影响靶向治疗的效果。研究人员检测40例肺癌患者MRD，发现53%的患者具有与酪氨酸激酶抑制剂或免疫检查点抑制剂良好反应相关的ctDNA突变谱[34]。同时，辅助治疗期间的ctDNA监测可能有助于临床了解药物反应和耐药性机制，为疾病快速进展之前的基于基因组治疗提供机会[34-35]。越来越多的证据表明，ctDNA可以作为MRD检测的生物标志物，进行准确的风险评估和辅助治疗。有研究人员利用生物传感器将目标分析物检测转化为可量化的数字信号，可以检测到肺癌MRD中较低水平的ctDNA和CTCs。MRD诊断的广泛应用可以降低成本，扩大检测的可用性[36]。

3.6 胸腔积液液体活检

目前液体活检最常用的是血清样本，但是胸腔积液也可以作为液体活检的样本，它同血清样本一样具有获取方便、可动态观察等优点。研究发现，胸腔积液上清液中的总cfDNA浓度中位值显著高于血浆(278.1 ng/mLvs.20.4 ng/mL，P<0.05)，且其中检出驱动基因突变的敏感性更高(93%vs.62%)[37]。此外，胸腔积液液体活检能协助鉴别胸腔积液的性质，指导肺癌患者的治疗和评估预后[38]。这说明胸腔积液样本用于液体活检也是未来值得探索的一个方向。

4 小结与展望

综上所述，液体活检与传统组织活检相比，具有便捷、微创、可重复、可动态观察等优势。虽然影像学、传统肿瘤标志物、组织活检仍是肺癌诊疗中的常用方法，但是液体活检有望作为其辅助手段，在肺癌的筛查和早期诊断、指导治疗、评估疗效和预测预后等多领域产生临床应用价值。在临床工作中，医生可以通过将液体活检与影像学检查、传统肿瘤标志物、组织活检等相结合，根据实时基因信息，为患者提供更精准化和个性化的医疗。

不可否认的是，液体活检在临床广泛应用前仍面临不少问题。(1)检测技术尚不成熟。虽然通过富集、扩增等手段可提高液体活检的敏感度，但是存在信息不完整、基因错配等现象。因此，在应用液体活检时应针对敏感度、特异度、稳定性等进行技术改进，同时对检测流程进行标准化，对关键节点进行质量控制。(2)缺乏临床验证。目前，液体活检缺乏大数据的人群调查和一致性评价研究，迫切需要更多的多中心、大型、前瞻性长期研究。(3)缺乏行业标准和市场监管。液体活检是一种新技术，急需制定规范的行业标准及执行严格的市场监管。(4)检测成本较高：液体活检成本较高，且尚未纳入医保范围，需要政府、医疗单位、检测公司等多方协调和投入[39]。相信随着上述问题的解决，液体活检在临床工作中将会有更广阔的应用前景。