D-二聚体及FIB 对ALK 阳性并服用克唑替尼治疗的肺癌患者无进展生存期的预测价值

于海洋，潘跃银

（安徽医科大学附属省立医院肿瘤内科，安徽 合肥 230001）

肺癌（lung cancer）是我国最常见且致死率最高的恶性肿瘤，其中又以肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）所占比例最高，5 年生存率仅为4%～17%[1]。间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）是LUAD 的重要分子靶点，3%～5%的非小细胞肺癌患者存在ALK 基因重排[2]。克唑替尼是一种腺苷三磷酸竞争性酪氨酸激酶抑制剂，可以通过靶向抑制ALK，进而发挥遏制肿瘤进展的作用[3]。然而，服用克唑替尼治疗的患者大多会在1 年内产生耐药性[4]，因此有必要寻找一个简便的指标预测患者的治疗效果。D-二聚体（D-dimer，D-D）是由凝血系统激活形成的交联纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）的裂解产物，是凝血系统异常亢进的信号[5]。研究表明，血浆中D-D 的水平对结直肠癌[6]、卵巢癌[7]和非小细胞肺癌[8]患者的治疗效果均具有一定预测价值。本研究通过Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中ALK 阳性肺癌患者克唑替尼耐药前原发灶和耐药后肝转移灶之间的转录组数据进行潜在机制的探索，随后通过回顾性收集临床数据来分析D-D 及FIB 水平对ALK 阳性并服用克唑替尼治疗的肺癌患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）预测作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 转录组资料 下载来自GEO 数据库中编号为GSE125864 数据集的转录组数据和临床信息，应用R 语言对GEO 数据库中ALK 阳性肺癌患者克唑替尼耐药前原发灶和耐药后肝转移灶之间的转录组数据的基因探针、名称、表达量进行预处理，并同时下载基因表达谱原始数据及临床数据以便进行生存分析。

1.2 临床资料 随后收集安徽医科大学附属省立医院2014 年7 月-2020 年7 月122 例诊断为ALK 阳性并服用克唑替尼治疗的肺癌患者的临床资料，包括年龄、性别、吸烟史、临床分期、转移部位、治疗线数、红细胞（red blood cell，RBC）数值、白细胞（white blood cell，WBC）数值、血小板（platelet，PLT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、国际标准化比率（international normalized ratio，INR/PT-INR）、部分活化凝血酶原时间（active partial thromboplastin time，APTT）、FIB、D-D，并从患者首次服用克唑替尼的时间开始进行随访，随访日期截止到2020 年12 月，PFS 定义为从患者开始服药至发生疾病进展或其他任何原因发生死亡的时间。纳入标准：①经病理学和或组织学诊断为ALK 阳性的肺癌患者；②服用克唑替尼时间不少于1 个月；③依据国际抗癌联盟肺癌TNM 分期为Ⅲ或Ⅳ期；排除标准：治疗前存在明显肝、肾功能损害、凝血障碍和或其他严重身心疾病。本研究经医院伦理委员会审批通过，患者知情同意并签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 差异基因分析 通过R 语言（3.63 版）DEseq2软件包进行差异基因分析，设置原发组作为参考组，肝转移灶组作为实验组，参数设置log FoldChange=1，P＜0.05。

1.3.2 核心基因筛选 基于在线生物信息学在线数据库DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）进行通路富集分析；Cytoscape 软件通过MNC、Degree、EPC、Eccentricity、Closeness 共5 种计算方式筛选关键枢纽（Hub）基因。

1.3.3 核心基因生存分析 GEPIA 在线生存分析工具（广泛应用的肿瘤TCGA 数据库的挖掘网站http://gepia2.cancer-pku.cn/）用于绘制关键Hub 基因的表达量与患者预后总生存期（overall survival，OS）相关的生存曲线。生存分析设置：①癌症类型：肺腺癌和肺鳞癌；②方法：OS；③分组依据：基因表达中位值。

1.3.4 京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集 R 软件（3.63 版）中内置的“clusterProfiler”用于对差异分析中满足筛选条件的差异基因进行KEGG 通路富集分析及可视化，并依据P值大小进行排序展示，筛序标准：P＜0.05。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0 及R 等统计学软件进行临床数据分析与绘图。采用Kaplan-Meier 法对不同分组间进行生存分析并绘制PFS 曲线。根据治疗前血液指标构建受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线，用曲线下面积（area under curve，AUC）评价其诊断价值。计量资料以（）表示，采用t检验；计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验；相关分析采用Spearman 检验；单因素、多因素分析采用Cox 回归分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异基因及通路富集分析 以原发病灶作为对照组，服用克唑替尼的配对肝转移灶中180 个差异基因上调，170 个差异基因下调（图1A）。对差异基因进行KEGG 通路富集分析显示，基因主要富集于补体及凝血级途径（图1B）；对上述差异表达基因进行蛋白-蛋白互作网络网络分析，并将得到的结果通过cytohubba 软件进行Hub 基因的筛选，为了排除单一算法产生的误差，采用MNC、Degree、EPC、Eccentricity、Closeness 共5 种计算方式筛选Hub 基因，并对得到的结果取交集得到FGA、FGG、APOA1以及APOB 关键Hub 基因（图2A）；通过对TCGA数据库中的肺癌患者进行生存分析显示，FGA 和FGG 低表达组的中位总生存时间长于高表达组（图2B、2C）。FGA 和FGG 分别编码FIB 的α 和γ 链，FIB 的部分裂解产物为D-D。

图1 克唑替尼耐药转移组织与原发组织中差异基因比较

图2 核心基因及其生存分析

2.2 临床数据分析

2.2.1 一般资料 共纳入122 例ALK 阳性并服用克唑替尼治疗的肺癌患者，具体临床特征见表1。

表1 患者临床特征（n，%）

2.2.2 预测价值分析 根据平均PFS 值评估基线血液参数值的ROC 曲线（状态变量：PFS=17 个月）。以RBC、WBC、PLT、PT、PT-INR、APTT、TT、FIB、D-D为基线数据，ROC 曲线分析显示，FIB、D-D 对PFS有良好的预测作用（AUC=0.798、0.906），FIB 的Cutoff 值为3.165（敏感度为88.20%，特异度为63.00%），D-D 的Cut-off 值为0.655（敏感度为81.60%，特异度为84.80%），见图3。

图3 治疗前血液参数的ROC 曲线

2.2.3 Kaplan-Meier 生存分析 Kaplan-Meier 分析显示显示，122 例患者中低WBC 组的PFS 长于高WBC 组；低PT 组的PFS 长于高PT 组；低PT-INR组的PFS 长于高PT-INR 组；高TT 组的PFS 长于低PT-INR 组；低FIB、D-D 组的PFS 长于高FIB、D-D 组（P＜0.05），而其他血液参数组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 患者PFS 的Kaplan-Meier 分析

图4 患者PFS 的Kaplan-Meier 分析（续）

2.2.4 单因素及多因素分析 单因素Cox 回归分析显示，PT、PT-INR、FIB、D-D 与PFS 相关，见表2。多因素Cox 回归分析显示，D-D 和FIB 水平可作为评估ALK 阳性并服用克唑替尼治疗的肺癌患者PFS 独立预测因子，见表3。

表2 单因素Cox 回归分析

表2（续）

表3 多因素Cox 回归分析

3 讨论

D-D 广泛应用于血液系统疾病的诊治中，包括血栓性疾病[9]、心血管疾病[10，11]治疗结局的预测。既往关于癌症与凝血因素的相关性研究表明，血浆中D-D 及FIB 的水平对结直肠癌[6]、卵巢癌[7]、肺癌[12，13]、尿路上皮癌[14]以及乳腺癌[15]等多种癌症患者的治疗效果及预后具有一定预测价值。然而大多数研究多集中在整个癌症种类上，而忽略了不同癌种的分子分型及单独的靶向药物治疗。

恶性肿瘤细胞中纤维蛋白溶解活性较高，且伴有大量FIB 激活物分泌，致使局部纤维蛋白溶解，从而引起血浆中D-D 与FIB 含量水平升高。研究显示[16]，肺癌患者常伴随凝血-纤溶功能异常，凝血纤溶系统的激活直接参与肿瘤的发展进程。Gieseler F 等[17]研究表明，肺癌细胞不仅能激活内皮细胞表达凝血因子，也能被其它细胞因子活化释放组织因子，从而活化外源性的凝血纤维蛋白溶解通路，而凝血纤维蛋白溶解系统异常又可进一步导致肿瘤基质形成和血管生成。一项有关于肿瘤与高凝状态作用的研究报道[18]，肿瘤患者预防用抗凝剂可取得一定的生存获益。Klerk CPW 等[19]研究表明，皮下注射低分子肝素的短期疗程有利于晚期恶性肿瘤患者的生存获益。在小细胞肺癌患者的治疗中，联合使用低分子量的肝素可使患者获得更佳的抗肿瘤效果[20]。这些关于凝血状态异常与肿瘤治疗的研究表明，凝血机制的异常激活或可导致肿瘤患者的进展和较差的预后，通过联用抗凝药物或可在一定程度上改善患者的治疗效果，延长患者生存时间。

Wang X 等[21]研究发现，编码FIB α 链的FGA与编码FIB γ 链的FGB 过表达或可导致机体高凝状态的产生。本研究中Hub 基因的筛选和基因预后分析表明，核心基因FGA 与FGG 的高表达与肺癌的不良预后相关。此外，通过收集并分析接受克唑替尼治疗ALK 阳性患者的治疗前血液参数和临床信息，结果发现122 例患者中低WBC 组的PFS 长于高WBC 组；低PT 组的PFS 长于高PT 组；低PTINR 组的PFS 长于高PT-INR 组；高TT 组的PFS 长于低PT-INR 组；低FIB、D-D 组的PFS 长于高FIB、D-D 组（P＜0.05），而其他血液参数组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；且单因素Cox 回归分析显示，PT、PT-INR、FIB、D-D 与PFS 相关；多因素Cox 回归分析显示，D-D 和FIB 水平可作为评估ALK 阳性并服用克唑替尼治疗的肺癌患者PFS 独立预测因子。以上研究结果提示，FIB 及D-D 水平对于ALK阳性并服用克唑替尼治疗的肺癌患者治疗效果及预后具有一定的预测价值。

综上所述，治疗前FIB 和D-D 高水平提示ALK 阳性并服用克唑替尼治疗的肺癌患者治疗效果及预后较差，且FGA、FGG 高表达可能是导致患者快速进展的潜在机制之一，有待进一步的功能学实验验证。