短链脂肪酸通过免疫机制和内分泌环境影响骨代谢的机制进展

刘小峰 张贤 李超 邵家豪 刘智中

1.南京中医药大学，江苏 南京 210023

2.南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡 214071

骨代谢是一个骨重建的动态平衡过程，即以成骨细胞为主导的骨形成和破骨细胞为主导的骨吸收。骨质疏松是由于骨形成减少，骨吸收增加，导致骨骼密度降低的一种疾病。近年来肠道菌群的主要代谢产物短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)在骨代谢方面的研究已经成为热点。本文通过国内外相关文献就SCFAs是如何通过免疫机制和内分泌环境影响骨代谢进行综述。

1 SCFAs的来源、代谢及分布

肠道菌群是多种微生物群落的总称。人体摄入的营养物质大多在小肠中被吸收，剩余的难以被消化的碳水化合物(统称为膳食纤维)被结肠中厌氧菌通过发酵形成SCFAs，SCFAs是含有不少于6个碳原子的饱和脂肪酸，最丰富的是乙酸、丙酸、丁酸，分别以大约3∶1∶1的比例存在于结肠中[1-2]。人体摄入的膳食纤维的数量和类型是肠道菌群产生SCFAs的数量和类型的主要决定因素之一[3]。乙酸盐是由多种类型的细菌产生的，丙酸盐和丁酸盐是由数量有限的细菌产生，例如，艾克曼菌从肠黏液层的消化中产生乙酸和丙酸[4-5]，普拉梭菌和霍氏真杆菌从消化中产生丁酸[6]。其中大多数乙酸通过门静脉到达肝脏被肝脏吸收，丁酸盐被结肠细胞用作能量来源，乙酸盐和丙酸盐被代谢并部分氧化或用作糖异生和脂肪生成的底物。SCFAs可以影响机体的炎症反应、免疫应答、内分泌调节和能量代谢等过程，来维持整个机体的代谢过程。

2 SCFAs通过免疫机制调节骨代谢

SCFAs具有免疫调节功能，T细胞和B细胞是免疫机制中重要的免疫细胞，T细胞是由胸腺中淋巴干细胞分化而成；B细胞是由骨髓中的造血干细胞分化发育而成，二者都参与骨代谢过程的调控，对骨形成和骨吸收发挥重要作用。研究显示SCFAs可以影响T细胞和B细胞的分化发育调节骨代谢。

2.1 T细胞

SCFAs可以通过调节T细胞免疫机制影响骨代谢。Croes等[7]认为，保持促炎辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)和抗炎调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)之间的平衡状态是调节骨代谢的重要因素。之前的研究显示，SCFAs可以通过调控TH17 细胞的分泌刺激骨吸收，也可以通过调控Treg细胞的分泌刺激骨形成和抑制骨吸收。一方面，SCFAs可以增加肠道中TH17细胞的分泌，一部分TH17细胞向骨髓中迁移，分泌IL-17、IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)，诱导破骨细胞的生成[8]；另外，IL-17可以促进成骨细胞释放核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)，当RANKL与破骨前体细胞上表达的核因子-κB受体激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)结合后，通过TNF受体相关因子-6激活下游分子如核因子κB、AP-1、P38和转化生长因子激酶1[9]，启动破骨细胞分化的信号的级联反应，促进破骨细胞的生成[10]。另一方面，SCFAs诱导幼稚CD4+T细胞在骨髓中分化为Treg细胞，Treg细胞激活NFAT和SMAD信号转导，NFAT和SMAD结合Wnt10b启动子区(碱基为705～272)激活Wnt10b，诱导CD8+T细胞中Wnt10b的产生，CD8+T细胞是Wnt10b的主要来源，Wnt10b是Wnt信号传导的有效激活剂，从而激活成骨细胞Wnt信号刺激骨形成[11]；另外，Zaiss等[12]也发现SCFAs可以抑制组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)诱导Treg细胞的分化和下调破骨细胞代谢的重编码，抑制破骨细胞的生成和分化；因此，保持TH17细胞和Treg细胞之间的平衡对调节骨代谢十分重要。最近研究显示，SCFAs可增加幼稚CD4+T细胞的最大耗氧率，使其向Treg细胞分化增加，并减少向TH17细胞的分化[13]。机制是丁酸盐激活PPARg重新编码能量代谢，促使糖酵解减弱而糖化磷酸化增强，从而促进T细胞更多的分化为Treg细胞，对骨代谢发挥作用[14]。除此之外，Yang等[15]研究发现SCFAs可以促进CD4+T细胞产生IL-22。IL-22是IL-10家族一员，IL-22可作用于类风湿性关节炎患者的滑膜和纤维细胞中，提高单核细胞趋化因子的产生，有利于单核细胞分化为成骨细胞。另一项研究表明，丁酸可以通过作用于GPR41和GPR43受体，促进活化CD8+T细胞的代谢[16]。一方面，终末分化的效应记忆CD8+T细胞可表达IFN-γ，IFN-γ的增加可抑制骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的成骨分化，Xu等[17]发现局灶性照射大鼠模型后，骨髓中的CD8+T淋巴细胞增加，通过减少MSCs的成骨分化，导致全身骨小梁减少和骨密度降低。另一方面，CD8+T细胞能够大量表达骨保护素(osteoprotegerin，OPG)，OPG与RANK竞争结合RANKL，当OPG与RANKL结合之后，可抑制破骨细胞的分化；当RANK与RANKL结合之后，激活核因子κB，引起破骨细胞的基因表达，促进破骨细胞的生成。

2.2 B细胞

SCFAs可以通过调节B细胞免疫机制调节骨代谢。研究发现，B细胞家族可以产生骨髓中64%的OPG，其中40%来源于成熟B细胞，除此之外，T细胞通过CD40配体(CD40 L)到CD40共刺激，促进B细胞在体内产生OPG[18]。OPG可以抑制RANKL来促进成骨细胞的分化。另一项研究发现，B淋巴细胞通过结节性硬化症复合体1(tuberous sclerosis complex 1，TSC1)/哺乳动物的雷帕霉素靶标(mTOR)/蛋白激酶B(AKT)信号转导途径控制RANKL/OPG比率，从而调节破骨细胞的形成。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)是mTOR的一个功能复合体。TSC1是mTORC1的上游负调控因子，Liu等[19]研究发现，在骨细胞TSC1缺失小鼠模型中，骨细胞mTORC1被激活，导致骨骼中的硬化素减少，促进了骨吸收，这说明TSC1/mTORC1对调节骨代谢发挥重要作用。另外，Xu等[20]研究证明，mTORC1在B细胞中被激活后，能刺激RANKL的转录，但会通过AKT/β-catenin通路负调控OPG的表达。mTORC1是通过抑制AKT和破坏β-catenin mRNA来下调β-catenin，β-catenin已被证明可以抑制RANKL的转录和促进OPG的转录，所以激活mTORC1会导致RANKL的转录增加，OPG表达下降。SCFAs通过影响mTOR转录因子的表达，影响RANKL/OPG比率，SCFAs还可影响OPG的产生，从而调节破骨细胞的分化。

3 SCFAs通过内分泌环境调节骨代谢

SCFAs可以通过内分泌环境参与骨代谢的调控，通过影响相关激素的分泌影响成骨细胞和破骨细胞的分化发育，目前研究较多的是胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)。

3.1 胰岛素样生长因子-1

IGF-1主要来源于肝脏，其他肌肉、组织或脏器通过旁分泌和自分泌方式发挥作用。IGF-1通过与成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞的同源受体结合，发挥调节骨代谢的作用。IGF-1通过激活AKT-mTOR通路，促进成骨细胞mRNA翻译，刺激成骨细胞的活化、增殖[21]。成骨细胞又通过胰岛素受体底物应答IGF-1信号，促进RANKL分泌增加，RANKL与RANK结合之后，激活核因子κB，引起破骨细胞的基因表达，促进破骨细胞的活化、增殖，使骨周转率加快。

年龄、营养状况等都会影响体内IGF-1的分泌，Schwarzer等[22]用同龄且喂食相同的小鼠做对比。研究发现，正常肠道菌群定植小鼠的生长速度比无菌(GF)小鼠生长速度快，且股骨长度和骨量都比GF小鼠高，表明肠道菌群影响骨骼的生长和重塑。另外，他们检测了小鼠血清IGF-1水平，发现正常定植的小鼠血清IGF-1水平比GF小鼠升高两倍，且成骨细胞中IGF-1的mRNA水平显著高于GF小鼠，同时矮小相关转录因子(Runx2)(骨髓中IGF通路的下游靶标)水平也增加[23]。这与他们之后用BALB/C背景小鼠进行实验的研究结果一致[24]，说明肠道菌群可以上调肝脏来源的IGF-1水平来调节骨骼的生长。然而在另外一项研究中，Yan等[25]用GF小鼠定植肠道菌群1个月后，骨小梁减少，体重减轻，检测发现定植1个月小鼠，血清IGF-1水平增加，血清骨吸收标志物Ⅰ型胶原C端肽(CTX-1)增加，同时血清骨形成标志物前胶原I型N末端前肽(P1NP)也显著增加，继续定植8个月后骨小梁增加，体重增加，血清IGF-1水平仍明显升高，这表明肠道菌群可以上调血清IGF-1的水平，肠道菌群短期定植可同时促进小鼠骨形成和骨吸收，但是骨小梁减少的原因可能是由于骨吸收的瞬时增加所致；长期定植的小鼠骨小梁增加，体重增加，原因可能是此时骨形成作用远超过骨吸收。肠道菌群的发酵产物主要是SCFAs，正常定植小鼠体内SCFAs浓度比GF小鼠更高。为了探讨肠道菌群影响IGF-1水平的中间介质，Yan等[26]的研究将常规小鼠用抗生素(广谱抗生素或万古霉素)治疗后，小鼠盲肠中SCFAs的浓度显著降低，血清IGF-1、PINP水平显著下降。继而在抗生素水中添加SCFAs进行4周处理后，SCFAs补充剂将小鼠体内的循环IGF-1水平恢复至非抗生素治疗的小鼠水平，但骨小梁和骨量降低，血清胰岛素样生长因子结合蛋白3没有变化，表明SCFAs可能增加了小鼠游离的IGF-1水平，IGF-1对骨代谢的作用类似于短期定植。因此，他们做了进一步实验，发现SCFAs补充剂处理的小鼠体内肝脏和脂肪组织IGF-1水平升高。这表明肠道微生物群影响骨骼形成的一种机制是通过非消化性纤维生成SCFAs，直接或间接作用于宿主的肝脏和脂肪组织，促进宿主循环IGF-1的产生并调控机体的骨代谢。以上研究结果表明，SCFAs可以提高IGF-1水平，但肠道菌群短期定植和长期定植的小鼠骨小梁却有显著的差异，其中原因是否是由IGF-1分泌导致，或者是否存在其他的分泌物影响骨代谢，还需要进一步的探讨。

3.2 胰高血糖素样肽-1

GLP-1是一种氨基酸激素，由肠L细胞以酰胺肽的形式分泌。相关研究已证明GLP-1能促进骨形成，抑制骨吸收，能增加骨密度和改善骨质量。在促进骨形成方面，GLP-1与GLP-1受体结合后，激活蛋白激酶A，经由骨陷窝细胞上的Wnt/β-catenin通道介导，使骨陷窝分泌的硬化蛋白水平降低，对骨形成标志物碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原合成抑制减弱，从而促进骨形成[27]。在抑制骨吸收方面，GLP-1与GLP-1受体结合后，破骨细胞的数量降低，骨吸收的标志物下降[28]。另外，研究显示，GLP-1受体表达于甲状腺C细胞，并能由cAMP介导促进降钙素的分泌，从而间接抑制骨吸收[29]。

肠道菌群的代谢物SCFAs会影响GLP-1的分泌，影响成骨细胞和破骨细胞的活性从而影响骨代谢。众所周知，SCFAs主要与肠道内分泌L细胞上的SCFAs受体FFAR2(GPR43)、FFAR3(GPR41)结合，促进GLP-1的分泌[30]。Psichas等[31]用生理浓度的丙酸注入到野生型小鼠的结肠中，发现实验组小鼠体内的GLP-1水平明显高于用生理盐水处理的小鼠体内的GLP-1水平。继而用丙酸处理FFAR2[-]小鼠，发现野生型小鼠体内的GLP-1水平明显高于FFAR2[-]小鼠。说明SCFAs是通过与G蛋白偶联受体FFAR2、FFAR3结合影响GLP-1的分泌。Tolhurst等[32]研究发现，SCFAs与L细胞上的SCFAs受体结合后，L细胞中Ca2+水平增加与GLP-1分泌增强之间存在直接联系。除此之外，SCFAs似乎还可以通过上调胰高血糖素原以及前激素转化酶1的表达来增加GLP-1的合成[33]。然而，Arora等[34]研究发现，GF小鼠体内的GLP-1分泌水平比常规饲养小鼠高2倍以上。肠道菌群定植的小鼠体内SCFAs水平较GF小鼠SCFAs水平高，但抑制L细胞的数量。Zhao等[35]做了进一步的研究，表明SCFAs驱动肠上皮细胞中蛋白质蛋白质O连接N-乙酰葡萄糖胺糖基化(O-GlcNAcylation)的水平，负调节L细胞发育。他们用广谱抗生素(庆大霉素、万古霉素、新霉素等)治疗C57BL/6小鼠2周，通过16 s RNA测序发现小鼠体内肠道微生物群多样性显著下降，SCFAs的分泌水平显著降低，同时伴有结肠O-GlcNAcylation水平的下降。此外，给小鼠口服SCFAs(乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐)的混合物之后，可以明显恢复小鼠结肠O-GlcNAcylation水平。他们做了进一步的实验，用OSMI-1(O-GlcNAcylation抑制剂)处理小鼠，发现可以逆转SCFAs对GLP-1的抑制作用，增加了GLP-1的分泌。这些结果表明，SCFAs通过促进蛋白O-GlcNAcylation水平来抑制肠道L细胞的数量，从而影响肠道L细胞分泌GLP-1。同样，Larraufie等[36]研究也发现，SCFAs特别是丙酸盐、丁酸盐都会抑制小鼠体内L细胞的数量，从而抑制GLP-1的分泌，从而影响骨代谢。出现以上差异的原因可能是由多方面导致的，不能排除其他微生物与宿主相互作用引起GLP-1水平的变化，或者SCFAs在与机体相互作用时，是否衍生出其他代谢物或信号分子来影响GLP-1的变化，还需要进一步探讨SCFAs影响GLP-1分泌的内在机制。除此之外，法尼醇X受体也参与SCFAs诱导的GLP-1水平分泌。法尼醇X受体的激活，使FFAR2基因表达下调，抑制GLP-1水平的分泌,从而影响骨代谢[37]。

4 结语

在SCFAs通过免疫机制调节骨代谢方面，研究认为保持TH17细胞和Treg细胞之间的平衡状态是调节骨代谢的重要因素。TH17细胞分泌增加会促进骨吸收。Treg细胞通过激活Wnt10b信号通路有助于骨形成，还可以下调破骨细胞代谢的重编码过程抑制骨吸收。SCFAs能促进CD4+T细胞更多的向Treg细胞分化，并减少其向TH17细胞的分化，这有助于机体骨量的健康。SCFAs能促进CD8+T细胞的代谢，从而大量表达OPG，通过RANKL/RANK/OPG通路直接或间接调控骨代谢。SCFAs可以影响mTOR转录因子的表达，通过TSC1/mTOR/AKT信号转导途径控制RANKL/OPG比率，从而调节破骨细胞的水平，参与骨代谢的调节。在SCFAs通过内分泌环境调节骨代谢方面，SCFAs能促进宿主循环IGF-1水平的增加，并调控机体的骨代谢。SCFAs是通过与G蛋白偶联受体FFAR2、FFAR3结合影响GLP-1的分泌，另外，SCFAs似乎还可以通过上调胰高血糖素原以及前激素转化酶1的表达来增加GLP-1的合成，GLP-1分泌增加能促进骨形成，抑制骨吸收，从而影响机体的骨代谢。

综上所述，本文就SCFAs如何通过免疫机制、内分泌环境影响骨代谢作了进一步的阐述。对于免疫机制，目前研究较多的是T细胞和B细胞；对于内分泌系统，目前研究较多的是IGF-1和GLP-1，它们都会对成骨细胞和破骨细胞的增殖和分化产生影响。随着科学技术的不断进步，SCFAs通过影响免疫机制、内分泌环境发挥调控骨代谢的作用已经取得了一些进步，但是这一领域仍然存在一些有待解决的问题。例如，SCFAs影响GLP-1分泌水平调节骨代谢的过程中，一部分研究者表明SCFAs可促进GLP-1分泌，另一部分研究者表明SCFAs抑制GLP-1分泌，不同研究者出现相对立的研究结果，这都需要进一步探讨SCFAs影响GLP-1分泌的内在机制。进一步研究这些机制将从SCFAs途径防治骨质疏松提供坚实的理论基础。