中医药干预骨质疏松成血管-成骨耦联因子研究进展

张杰 董万涛 赵宝宝 赵张凯 王剑虹 常茹梦

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

骨骼是一种高度血管化组织，具有广泛的血管和毛细血管网络，其通过调节血管内皮细胞和骨细胞之间的不同信号通路来为骨的生长发育提供氧气及营养，在骨的形成、修复及重塑中起着重要的作用[1]。新生血管可将成骨细胞前体细胞与破骨细胞转运至特定位置。绝经后骨质疏松症伴有骨髓中窦状毛细血管和动脉毛细血管数量减少，导致灌注受限。此外，据报道，患有骨质疏松症(osteoporosis，OP)的老年妇女股骨的骨血流量减少[2]。现代医学研究[3]表明血供不足所致缺血缺氧在OP骨形成减少中具有重要的作用，尤其是毛细血管数量及血流量减少，可使成骨细胞处于低血供低氧状态，加速其凋亡，从而引起骨代谢的改变，导致骨生成减少、骨量丢失。成骨和血管生成之间密切的空间和时间联系被称为“血管生成-成骨耦合”。目前，现代医学治疗OP虽有一定的临床疗效，但仍具备患者依存性差及胃肠道等不良反应。中医药防治OP历史悠久，疗效显著。近年来，中医药通过调节成血管-成骨相关因子防治OP疗效显著。本文拟通过对相关研究成果进行综述，以期为中医药防治OP提供新的诊疗思路及靶点。

1 成血管-成骨耦联调节因子

1.1 血管内皮生长因子

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前最有效的诱导血管生成的高特异性生长因子，由参与骨生长与重塑的成骨细胞、肥大细胞、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及肥大软骨细胞所分泌，并可通过作用成骨细胞、破骨细胞以及骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem，BMSCs)来调节骨代谢[4]，对成血管-成骨耦联的机制有着关键作用。现代医学研究[5]证明，成骨细胞中VEGF低表达，将会导致骨内微血管减少、骨量减低、BMD下降，并给予外源性VEGF能显著促进血管生成及加速骨修复。庞海涛等[6]的研究证明，VEGF能通过上调colⅠmRNA表达水平及碱性磷酸酶(alkaline-phosphatase，ALP)浓度，明显提升BMSCs成骨分化活性。张连芳等[7]研究证明，VEGF能促进BMSCs成骨标志基因osterix、Runx2、ALP和骨钙素(osteocalcin，OCN)的表达血红素氧化酶1 mRNA蛋白水平的表达及抑制PPARc2活性表达，有效促进BMSCs的成骨分化并抑制其成脂分化。Andrea G等[8]研究证明，VEGF可以通过激活Akt/β-catenin通路刺激间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSCs)中内源性BMP-2的表达促进成骨细胞分化。VEGF/VEGFR2促进印度刺猬因子(Indian hedgehog，IHH)释放，抑制β连环蛋白(β-catenin)及Notch2信号表达，促进成骨细胞分化[9]。Huh等[8]研究证明，葛根素能显著提高VEGF mRNA表达，并且能促进成骨细胞增殖及ALP表达。骨碎补总黄酮能通过提高成骨细胞中VEGF和FGF-2的表达，从而增多成骨区域血管形成，促进腰椎及髋关节的BMD和骨矿物含量，进而防治OP[9]。三七总皂苷OVX大鼠进行干预，通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达，大鼠BMP2和VEGF水平出现明显上升，随着三七总皂苷剂量提高，BMP2和VEGF水平上升幅度越大，大鼠BVF、骨痂Tb.N明显增高以及Tb.Sp明显下降[10]。杜仲补肾健骨颗粒结合针灸治疗OP，可通过上调血清VEGF水平，降低TNF-α、TGF-β、PINP及BGP表达，促进骨增殖，降低骨质流失。减轻OP患者症状[11]。仙灵骨葆胶囊灌胃OVX大鼠，可通过上调骨折周围组织的PDGF、TGF-β和VEGF的相对表达，促进骨修复，延缓OP[12]。

1.2 血小板衍生生长因子-BB

血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor，PDGF-BB)是PDGF家族的趋化因子和促有丝分裂因子，在骨形成与修复过程中，骨髓和外周血中PDGF-BB主要来源于破骨细胞前体细胞，能够通过调节内皮细胞中VEGF促进血管形成与成骨分化[13]。Gao等[14]研究发现，巨噬细胞谱系抗酒石酸酸性磷酸酶阳性(TRAP+)单核细胞骨分泌PDGF-BB诱导骨膜素的转录与表达并向骨膜表面募集骨膜细胞，进而促进H型血管生成与成骨细胞的分化。Xie等[15]研究证明，PDGF-bb通过结合其受体PDGFRβ，促进间充质干细胞和内皮祖细胞迁移与分化，并且通过鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1 phosphoric acid，S1P)分泌耦合成骨过程中诱导FAK/PI3K/Akt依赖性的血管生成。Wang等[16]研究证明，黄芪甲苷通过激活AKT/GSK-3β/β-catenin通路抑制多核破骨细胞形成并保护破骨前细胞，使PDGF-BB表达增强，且能够BMSC的存活及成骨能力，进而进一步增强成骨和血管生成的耦联作用，从而防治OP。Shen等[17]研究证明，骨碎补总黄酮通过PDGF-BB/PDGFR-β通路促进H型血管生成使得EPCs活力及PDGF-BB表达提升，并且显著提高BMSCs的成骨分化，增加ALP活性及RUNX2和OSXmRNA和蛋白质水平，从而增强成血管与成骨之间的耦联。Cheng等[18]研究证明，通过荷叶碱灌胃治疗OVX大鼠，抑制Trap+破骨细胞融合成多核破骨细胞，促进其产生PDGF-BB分泌和H型血管的形成，能够通过调控MAPK/NF-κB/c-Fos/NFATc1信号通路有效减缓破骨细胞形成，减缓骨吸收，促进骨形成与重塑。陈等[19]研究表明，通过给予OP患者温阳补肾汤治疗，与对照组相比其降低血清VCAM-1水平PDGF-BB、BGP水平明显增长，进而明显改善OP症状。

1.3 血管生成素-1

血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)为在成骨细胞、破骨细胞和部分骨髓间隙细胞中表达的分泌型生长因子。并能促进血管内皮细胞(endothelial cell，ECs)的周向增殖，通过促进MCs和ECs之间的粘附来诱导血管结构稳定促进骨形成[20]。Jeong等[21]的研究显示，Ang-1能与其受体Tie2结合并使其磷酸化导致PI3-kinase/AKT信号通路激活，诱导血管生成。并协同增强BMP2表达且AKT、Smads及p38 MAPK磷酸化，促进成骨细胞分化与增殖。通过给予中药水飞蓟宾和铜-水飞蓟宾衍生物，能显著提高小鼠BMSC中VEGF和Ang-1 mRNA的表达水平，从而刺激血管生成及成骨分化[22]。邓等[23]研究证明，补肾活血中药复方可明显提高Ang-1 mRNA表达水平及其蛋白含量，延缓OP。

1.4 碱性成纤维细胞生长因子

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是促细胞有丝分裂因子和血管生成因子，能有效诱导间充质祖细胞、内皮细胞和成骨细胞的有丝分裂，并且通过自分泌和旁分泌的作用刺激ECs增殖、迁移和表达与血管生成相关的蛋白酶、生长因子和整合素，从而诱导血管生成[24]。bFGF及其受体FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3和FGFR-4联合介导内皮细胞活动的信号级联反应[25]，bFGF在成骨细胞中，bFGF通过前列腺素和TGF-β生成，并通过自分泌和旁分泌等途径促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞分化[26]，Kim等[27]发现，bFGF可通过刺激Runx2的基因表达，促进成骨细胞分化。在破骨细胞中，bFGF通过调节破骨细胞分化因子如RANKL和COX-2诱导破骨细胞生成[28]。还可通过激活FGF受体和ERK信号通路调节破骨细胞性骨吸收[29]。丁强等[30]研究证明，淫羊藿苷可大鼠BMSC在bFGF诱导下表现出较高的成骨分化潜能，刺激皮质骨、松质骨的形成，并在成骨晚期可提高TGF-β1的表达水平。刘小波等[31]研究证明，柚皮苷可明显提高OPF大鼠股骨BMP-7，bFGF蛋白表达，提高其股骨BMD水平，并改善其股骨生物力学。夏永严等[32]研究证明，红景天苷通过上调bFGF、VEGF表达通过诱导血管生成，可减少成骨细胞凋亡，促进成骨细胞分化和骨形成。刘巍等[33]研究证明，半枝莲多糖治疗家兔下颌骨骨折，能够明显升高其静脉血VEGF、SGF、bFGF因子表达，Tb.N和Tb.Sp明显升高及骨折部位X线评分明显改善。邓雄伟等[34]研究证明，十全大补汤治疗气虚血瘀型OP老年患者血清OPG、TGF-β1、FGF-2均明显升高，加速骨质修复，抑制骨质破坏，改善症状。

1.5 转化生长因子β

转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是一种具有广泛生物学效能的生长因子，能够调节细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期，在骨生成和血管生成中有着重要的作用[35]。据报道[36]，在造血细胞和内皮细胞中VEGF的表达被发现受TGF-β的调节，这表明破骨细胞释放的TGF-β诱导BRC细胞中VEGF的表达，帮助维持骨重塑过程中的血管供应。Tang等[37]研究证明，TGF-β是一种强烈的趋化刺激因子，参与MSCs的募集和增殖，不仅可以调节成骨细胞的分化，还可促进成骨细胞前体向骨生长与重塑的部位募集，同时，TGF-β可促进细胞外基质合成及作用于成骨细胞前体细胞，调节成骨细胞增殖及分化，并且通过抑制破骨细胞的生成，有效促进骨生成和重塑，TGF-β能明显提高造血细胞和内皮细胞中VEGF的表达，以维持骨生长与重塑中的血管生成。李宁等[38]研究发现，麝香能够明显增加骨缺损大鼠骨组织的TGF-β、VEGFmRNA表达，成骨细胞及BMSC增殖、分化，促进骨重塑与骨修复。塔娜等[39]研究证明，异补骨脂素能明显刺激小鼠前成骨细胞活性及增殖，促进TGF-β1活性表达，对OP有防治作用。刘立柱等[40]研究发现，淫羊藿苷灌胃SD大鼠，其明显上调TGF-β1、VEGF和BMP-7的蛋白表达，ALP活性升高，OCN明显上升。陈冠儒等[41]研究表明，补肾活血方可以通过血流动力学明显增加骨折大鼠血清BMP-2、VEGF和TGF-β1 mRNA水平，促进成骨细胞生成，加速新生骨基质的合成和积累。张紫铭等[42]研究证明，用虎潜丸治疗OVX大鼠，是通过上调其腰椎BMD及肾组织中的TGF-β2以防治OP。孟玥等[43]通过对地塞米松致斑马鱼OP模型给予左归丸灌胃，能明显抑制其骨吸收并通过介导TGF-β1/Smads信号通路，增强BMD及骨生物力学，促进骨形成。

1.6 低氧诱导转录因子-1α

低氧诱导转录因子-1α(hypoxia-inducible transcription factor-1α，HIF-1α)与血管生成成骨耦合的调节密切相关，Kusumbe等[44]证明内皮HIF-1α是干骺端H型血管形成的重要启动子，缺氧状态下，导致HIF-1α的过表达，RUNX2、Osterix、ALP等标志物明显上调，促进成骨细胞的增殖及分化。在幼鼠体中，HIF-1α在H亚型血管中高表达，随着年龄的增长HIF-1α水平显著下降，并且H亚型血管HCs的减少和老年性OP有关。HIF-1α可通过调节OASIS蛋白、miRNA-675-5P调节骨血管生成以及骨髓间充质干细胞分化，最终可防治OP[45]。

YEN等[46]的研究表明薯蓣皂苷配基通过激活PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路诱导HIF-1α表达，并促进VEGF-A水平上升，促使成骨细胞中血管生成，从而促进骨生长和骨修复，防治OP。Guo等[47]研究证明，红景天苷可通过激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路，促进HIF-1α靶基因转录活性上升，进而上调VEGF表达，增加血管生成，促进成骨细胞的增殖、分化以及矿化来增强成骨作用。张晓军等[48]研究证明，三七总皂苷对去势骨质疏松性骨折模型大鼠进行干预，调控PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达，能够影响VEGF和HIF-1α水平，使去势骨质疏松性骨折大鼠BMD、骨细胞指数上升。Han等[49]研究证明，补肾通络汤在OVX大鼠动物模型中稳定了HIF-1α活性，随后增加了VEGF表达，并增强了血管生成和调节RANKL/OPG信号传导，保护了由卵巢切除引起的OP大鼠小梁骨密度和小梁骨微结构。

1.7 轴突导向分子3

轴突导向分子3(slit guidance ligand 3，Slit3)是一种新型的高度保守分泌糖蛋白家族中的一个亚型，能够调节编码形态发生因子基因的转录与表达，调节成骨细胞、破骨细胞及血管内皮细胞的发育[50]。Xu等[51]研究发现成骨细胞源性Slit3可通过其促血管生成因子的间接作用促进骨形成，Slit3基因敲除导致H型血管内皮细胞生成降低、成骨细胞增殖减弱。重组蛋白Slit3能激活ERK、MAPK和Hippo信号通路促进H型血管生成、骨重塑与骨形成。Kim等[52]研究证明，破骨细胞源性的Slit3通过激活β-连环蛋白(β-catenin)的活性并与其N-钙粘蛋白(N-cadherin)解离刺激成骨细胞分化与增殖，并以自分泌的方式抑制破骨细胞活性。桑晓文等[53]研究证明，芪骨胶囊可明显提升IGF-1、Slit3的表达，促进骨内血管新生，能明显促进骨形成，减缓绝经后骨质疏松症的症状。

1.8 音猬因子

音猬因子(sonic hedgehog，Shh)在Hedgehog家族中表达最为广泛，该信号通路对于颅面骨、四肢骨及轴骨等骨骼的形成发挥着重要的作用[54]。据报道，Shh过表达导致VEGF、IGF-1、HGF、Ang-1表达水平增加，促进血管生成[55]，并且刺激多能间充质细胞中骨粘连蛋白(osteonectin，ONN)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、OCN及ALPmRNA表达上升，促进成骨细胞分化[56]，James等[57]研究发现N-shh作用于基质干细胞上调成骨分化标志转录因子(runtrelated transcription factor 2，Runx2)及ALP表达，促进骨生成与骨重塑。Spinella等[58]研究发现，N端重组蛋白(N-Shh)能够通过激活Smad信号传导上调BMP-2、BMP-4及ALP活性表达，进而促进多能间充质细胞成骨分化并抑制其成脂分化。Jemtland等[59]研究证明，N-Shh通过上调甲状旁腺相关肽(parathyroid hormonerelated peptide，PTHr P)免疫PTHr P进而促进成骨细胞活性。辛红美等[60]研究证明，淫羊藿苷能够促进MC3T3-E1细胞Hedgehog信号通路关键基因shh的蛋白表达量明显上调，从而促进成骨细胞分化。韩宇等[61]研究证明，补骨脂素通过调控Hedgehog信号通路，致使Shh、Gli1 mRNA及蛋白表达显著提升，Ptch1 mRNA及蛋白表达显著降低，从而促进大鼠BMSCs成骨分化及增殖。邓洋洋等[45]运用补肾、活血中药干预去卵巢大鼠12周后，发现去卵巢大鼠血清中SHH、GLLI1蛋白含量显著升高，表明补肾活血中药复方可通过提高SHH、GLLI1蛋白及mRNA表达水平治疗OP。梁学振等[62]研究证明，补肾活血胶囊含药血清能够通过激活Hedgehog信号通路诱导Shh、Gli1的蛋白表达，促进BMSC的成骨因子Runx2、Col1a1的蛋白表达，降低成脂因子PPARγ、C/EBPα的蛋白表达，促进骨形成。

2 结语和展望

OP的发病率、致死率、致残率及医疗费用呈逐年增长的态势，骨的再生、修复及重塑均依赖于微血管的动态平衡。中医药防治OP具有全方位、多环节、多靶点、广谱及高效的集合作用。成血管-成骨耦联机制的发现，阐明了骨组织中的毛细血管能够与成骨细胞、破骨细胞、成骨细胞前体细胞、破骨细胞前体细胞、骨髓间充质干细胞建立细胞因子调控网络，使血管新生与骨的形成通过调控VEGF、PDGF-BB、bFGF、ANG-1、TGF-β、HIF-1α、Slit3及Shh的表达相耦联。基于成血管-成骨耦联靶点，中医药在治疗OP方面疗效显著，但目前的研究多为动物实验，缺乏标准化的临床实验。由于复方组方作用多变且机制复杂，目前对单味药的研究主要以提取物为主。未来应立足于从分子生物学、细胞生物学进行多靶点的阐述中药治疗OP，同时结合多中心、大样本、双盲、随机对照临床研究，进一步将靶向成血管-成骨耦联机制的药物与传统药物或治疗技术相结合应用于临床诊治中。