不同浓度罗英化浊解毒方对胃癌大鼠病理改变、细胞凋亡及RegⅠ蛋白的影响

陈贵婧 张纨 孙建慧 王彩云 张亚丽 沙丹丹 董兴娟

(河北省中医院，河北 石家庄 050000)

胃癌由多种因素导致，最初癌细胞来源于胃黏膜上皮病变，常见的类型为腺癌。常见的诱发因素为癌前病变、环境、饮食等，早期胃癌患者无特异性症状，致使疾病的产生绿增加〔1〕。相关报道显示，饮食不规律所引起的胃癌发病率逐年增加，确诊时多为晚期，治疗困难，因此，对于胃癌的治疗至关重要。该病常见的治疗胃手术治疗，但手术易产生并发症等，不利于患者的预后。根据近年来的研究发现中医在治疗胃癌方面效果显著，中医认为胃癌的病因在于湿浊和热毒,罗英化浊解毒方是化解浊毒的一味中药,已有研究表明其对胃癌前病变患者体内的浊毒具有一定的治疗作用，但其对于治疗胃癌的相关文献较少，作用尚未完全掌握〔2〕。胃癌细胞的异常增加及向远处转移等可加快胃癌的发展。RegⅠ是Reg再生基因家族的一员，相关研究证实，RegⅠ在胃癌中水平较高,RegⅠ蛋白可作为促生长和抑凋亡因子，目前，已有相关学者证实其可抑制胃癌细胞的凋亡〔3〕。本研究不同浓度罗英化浊解毒方对胃癌大鼠病理改变、细胞凋亡及RegⅠ蛋白的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物 选取健康ACL雄性大鼠80只，2～4月龄，体重210～225 g，平均(213.25±12.37)g，购自亿鸣复兴(北京)公司，7 d后开始实验，大鼠常规饲养，室温维持在23.3～27.2℃，相对湿度在51%～62%，保持0.5 d光照，正常饮食饮水。

1.2实验药物 罗英化浊解毒方用水浸泡0.5 h，煎煮3次后取汁(200 ml)，离心，取上清，浓缩至1.5 kg/L，杀菌备用。详细药材及剂量：莪术4 g，茵陈6 g，郁金9 g，砂仁10 g，冬凌草、石菖蒲、元胡、叶下珠、罗勒、红景天各12 g，白英、蒲公英、藤梨根、八月札、隔山消各15 g。

1.3实验试剂 胃癌SGC-7901细胞株(上海和元公司)、罗英化浊解毒方中中草药材(亳州恒义公司)、阿糖胞苷(北京华迈科公司)、戊巴比妥钠(湖北鸿运隆公司)、TUNEL(邢台润联公司)、酶标仪(山东恒美公司)、RegⅠ、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)一抗(广州瑞博奥公司)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(河北翰林公司)。

1.4模型建立 取64只大鼠于腹部注射阿糖胞苷(200 mg/kg)，2 d后全身照射 60℃至吸收10 Gy。照射后2 d，胰酶消化胃癌细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬(1×1010/L)，将细胞悬液(0.8 ml)注射大鼠右腋皮下位置。1 w后，腋下长出1 cm肿块，建模成功64只。

1.5分组及给药 剩余16只大鼠为正常组，无处理。建立模型的64只大鼠分为模型组16只无任何处理，低剂量组16只给予20 mg/kg罗英化浊解毒煎剂灌胃，1次/d，高剂量组16只给予40 mg/kg罗英化浊解毒煎剂灌胃1次/d，对照组(药物对照组)给予225 mg/kg希罗达灌胃，2次/d，共12 w。

1.6检测指标

1.6.1苏木素-伊红(HE)染色光镜观察法检测各组大鼠胃黏膜组织形态 取各组大鼠，戊巴比妥钠麻醉后处死，取胃黏膜组织，置于4%甲醛缓冲液中固定，石蜡切片，脱蜡，乙醇水合处理，洗涤后进行染色，光镜下观察。

1.6.2TUNEL检测各组大鼠胃黏膜组织中细胞凋亡 取大鼠胃黏膜组织，滴加蛋白酶 K工作液常温反应 20 min，PBS 清洗，加入50 μl TUNEL工作液，常温无光孵育60 min，清洗，加 50 μl convertr-POD，上述条件孵育。PBS洗涤，4次，5 min/次，加图 DAB液显色10 min后，冲洗，苏木素复染，脱水透明，封片。随机取5个视野，计算凋亡率。

1.6.3酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中胃动素、胃泌素水平 取各组大鼠颈部动脉血2 ml，离心5 min，1 250 r/min，取上清，采用ELISA检测各组大鼠血清中胃动素、胃泌素水平。

1.6.4RT-PCR检测胃黏膜组织中血管内皮生长因子(VEGF)、自噬蛋白(Beclin1)水平 取各组大鼠胃黏膜组织，裂解液裂解，0.25%胰蛋白酶消化，提高组织RNA进行反转录得到总cDNA，分离后采用Trizol法提取总RNA，无核酸酶溶解。进行逆转录后将cDNA进行荧光反应实验。内参为β-actin，反应条件：5 min 94℃,变性30 s 94℃；55 s 64℃；50 s 72℃。共40个循环。计算方法用2-△△Ct法进行分析。引物序列：VEGF：上游引物：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′；下游：5′-TCACGCCACAGTTTCCCG-3′；Beclin1上游引物：5′-AATGAATGAGGGCGACAG-3′，下游：5′-TCAGGGACTCCAGATACGA-3′；β-actin上游引物：5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游5′-CAGGATTCCATACCCAAG-3′。

1.6.5Western印迹检测胃黏膜组织中RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白表达 取各组大鼠胃黏膜组织，600 μl裂解液裂解并提取蛋白,测量蛋白浓度,分装,-20℃保存。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液按4∶1比例混均,将蛋白溶液煮沸，变性。将电泳后的50 μm蛋白样品转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加脱脂奶粉封闭1 h。加入1抗(1∶500)RegⅠ、Bcl-2、Bax后，清洗3次，间隔10 min/次,最后加入辣根过氧化物酶2抗对溶液稀释,封闭1 h。取出PVDF膜,漂洗，二氨基联苯胺(DAB)显色后照相。严格按照试剂盒说明操作。

1.7统计学分析 采用SPSS23.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1各组胃黏膜组织形态检测结果 与正常组相比，模型组与低剂量组胃黏膜组织有炎性细胞浸润产生，排列杂乱无章、胃壁增厚，高剂量组与对照组胃黏膜组织炎性细胞浸润减少，排列较为有序。见图1。

图1 各组胃黏膜病理形态(HE染色，×200)

2.2各组胃癌细胞凋亡情况检测结果 模型组胃癌细胞凋亡率〔(4.11±0.42)%〕明显高于正常组〔(0.00±0.00)%；t=23.97，P<0.001〕。模型组明显低于低剂量组〔(26.31±2.13)%；t=25.05，P<0.001〕。低剂量组明显低于高剂量组〔(47.31±4.31)%；t=10.70，P<0.001〕。高剂量组明显高于对照组〔(34.32±3.11)%；t=5.99，P<0.001〕。见图2。

2.3各组血清中胃动素、胃泌素水平检测结果 正常组胃动素、胃泌素水平明显低于模型组(P<0.05)，模型组上述指标水平明显高于低剂量组(P<0.05)，低剂量组上述指标水平明显高于高剂量组(P<0.05)，高剂量组上述指标水平与对照组无差异(P<0.05)，见表1。

2.4各组VEGF、Beclin1 mRNA水平检测结果 与正常组相比，模型组VEGF mRNA水平明显提升、Beclin1 mRNA水平明显下降(P<0.05)。与模型组相比，低剂量组VEGF mRNA表达明显降低、Beclin1 mRNA表达明显提升(P<0.05)。与低剂量组相比，高剂量组与对照组VEGF mRNA表达明显降低、Beclin1 mRNA表达明显提升(P<0.05)。高剂量组与对照组VEGF mRNA、Beclin1 mRNA表达无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.5各组RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白水平检测结果 与正常组相比，模型组RegⅠ、Bcl-2水平明显升高，Bax水平明显下降(P<0.05)。与模型组相比，低剂量组RegⅠ、Bcl-2水平明显下降，Bax水平明显提升(P<0.05)。与低剂量组相比，高剂量组与对照组RegⅠ、Bcl-2水平明显下降，Bax水平明显提升(P<0.05)。与高剂量组相比，对照组RegⅠ、Bcl-2水平明显升高，Bax水平明显降低(P<0.05)。见表1、图3。

图2 各组胃癌细胞凋亡(TUNEL染色，×200)

表1 各组胃动素、胃泌素水平、VEGF、Beclin1 mRNA水平、RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白水平对比

图3 各组RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白表达

3 讨 论

胃癌的发病率在世界范围内位居第5，死亡率居于第3〔4〕。在我国，该病的发病率和死亡率分别位于第2、3位，高于世界平均水平。

胃肠激素可调节胃肠功能，胃动素与胃泌素是其中两种，胃动素主要定位于小肠，具有促进胃肠运动的作用，胃泌素是一种肽类物质，可刺进胃肠功能的运动及分泌，可调节机体的消化道并维持其功能正常运转〔5〕。中医认为胃癌基本病机是湿浊和热毒，罗英化浊解毒方中白英具有清热解毒、消肿利湿、抗癌的功效；砂仁具有健脾化湿、温脾止泻的作用。本研究显示胃泌素与胃动素水平较健康大鼠高，在经过药物干预后水平有所降低且呈现剂量依赖性，目前研究表明希罗达治疗胃癌效果较高，因此，本文选用希罗达作为药物对照组，罗英化浊解毒方水平对胃癌具有一定的治疗作用。在黎玉容等〔6〕对胃癌大鼠进行的实验中提出，胃动素与胃泌素水平在胃癌大鼠中为高表达，降低其水平后，大鼠的胃肠功能得到一定的改善。砂仁是罗英化浊解毒方中的一味中药材，在陶彦谷等〔7〕对胃溃疡的实验研究中提出，砂仁具有降低胃泌素及胃动素水平的作用。本研究结果与上述研究结果相似，且本文HE染色结果也表明在经过药物干预后胃癌大鼠胃黏膜组织形态有所改善。

新血管的形成是肿瘤发展的基础，VEGF具有促进血管新生的作用，是血管形成的关键因子，新生雪管的增加促进癌细胞远处转移，加重病情〔8〕。罗英化浊解毒方中冬凌草具有清热解毒、活血止痛、抗肿瘤等作用；郁金具有活血止痛、行气解郁等作用；石菖蒲理气活血祛湿的作用。肖麟等〔9〕对胃癌大鼠进行的实验提出，高水平的VEGF会增加肿瘤血管新生，促进胃癌发展，经过药物干预后，其水平降低，病情有所改善。石菖蒲与郁金是罗英化浊解毒方中的两味中药材，田军彪等〔10〕在实验中提出石菖蒲、郁金可降低VEGF水平，改对脑缺血再灌注大鼠的病情严重程度。本文与上述研究结果相似。

Reg再生基因家族具有促有丝分裂、抗凋亡、抗炎症等作用。已有研究证实其在结肠癌〔11〕、胃癌〔12〕等消化道肿瘤中均为高表达。RegⅠ是再生基因家族的成员之一，主要参与组织损伤与肿瘤的产生，相关研究表明〔13〕，RegⅠ表达与胃癌的分化程度、浸润性生长及预后具有一定的相关性。RegⅠ在胃癌中具有抗凋亡的作用。Beclin1是一种与自噬相关的抑癌基因，对自噬具有正性调节作用，自噬诱导的自噬性细胞死亡能够杀伤肿瘤细胞，进而抑制肿瘤发展〔14〕。已有学者证实〔15〕Bcl-2、Bax与细胞凋亡联系密切，Bcl-2是抗凋亡因子之一，低表达的Bcl-2 可提高Bax 水平加快细胞凋亡。罗英化浊解毒方中藤梨根具有抗肿的功效；冬凌草与莪术具有清热解毒、活血止痛、行气破血、抗肿瘤的功效。徐平平等〔16〕对胃癌大鼠的实验提出，通过提高胃动素与胃泌素的水平，改善了大鼠的胃功能，通过降低Bcl-2、提高水平加快癌细胞凋亡。朱飞叶等〔17〕对胃癌大鼠的实验提出，与健康大鼠相比，胃癌大鼠Beclin1水平较低，在经过药物干预后水平有所升高。张蕾等〔18〕在对胃癌细胞的实验中提出，通过降低Bcl-2、提高Beclin1、BAX水平可促进癌细胞的凋亡。冬凌草与藤梨根是罗英化浊解毒方中的两味中草药，程珊等〔19〕对胃癌细胞的实验提出，高表达的RegⅠ促进癌细胞的生长，通过降低RegⅠ、提高胃泌素水平可减少癌细胞增殖。王志坤等〔20〕对胃癌前病变大鼠的研究提出，冬凌草与藤梨根通过降低RegⅠ、PCNA水平抑制细胞增殖。本研究结果与上述医学者研究结果相似，罗英化浊解毒方通过降低RegⅠ水平抑制了Bcl-2的表达，促进了Bax、Beclin1表达，降低了胃动素与胃泌素水平，从而增加胃癌细胞的凋亡，改善肠胃功能。且本文TUNEL检测癌细胞凋亡的结果也可证实在经过罗英化浊解毒方治疗后癌细胞凋亡增加，且具有剂量依赖性。

综上所述，罗英化浊解毒方通过降低RegⅠ水平，改善了胃癌大鼠病理组织形态，促进了癌细胞的凋亡，且呈现明显的药物剂量依赖性。