基于RhoA/ROCK通路探讨赤芍总苷对心肌梗死大鼠心肌凋亡的影响

张涛 毛治尉 豆倩云 钱晨旭 赵智琛

(郑州大学附属郑州中心医院心血管内科，河南 郑州 450000)

心肌梗死(MI)是持续的缺血缺氧导致的心肌坏死性病变，产生氧化应激、炎症反应，出现心肌坏死和凋亡，心功能下降〔1〕。成年的心肌凋亡属终末分化细胞，一旦受损，很难修复，而心肌细胞损伤会降低心肌功能并导致疾病发生，且心肌细胞凋亡会进一步导致MI的恶化，影响左心室重构和加速心衰，因此减轻心肌细胞凋亡对MI具有较高意义。赤芍总苷(TPG)作为中药赤芍主要活性成分，研究发现其对心肌细胞凋亡具有保护作用〔2〕，但作用机制尚不清楚。抑制RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)通路可以抑制心肌细胞凋亡，实现对心肌的保护〔3〕。本研究探讨TPG是否通过RhoA/ROCK通路发挥对MI大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级健康SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)-2016-0006，6周龄，体重200～220 g，大鼠均在温度(25±1)℃、湿度(50±5)%、自然光照的实验动物中心常规饲养。所有实验经医院动物实验伦理委员会批准。

1.1.2药物、试剂与仪器 TPG(中国国际生物制品所)；RhoA激活剂溶血磷脂酸(LPA)(美国Sigma公司)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)凋亡试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3、RhoA、ROCK(英国Abcam公司)。小动物呼吸机(成都泰盟软件有限公司，型号：HX-101E)；心电图机(上海光电仪器有限公司，型号：ECG-6511)；全自动生化分析仪(康宇医疗器械有限公司，型号：BS-330E)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，型号：DxFLEX)；蛋白凝胶成像仪(美国Invitrogen公司，型号：E-Gel174)。

1.2方法

1.2.1动物造模与分组 30只大鼠采用冠状动脉左前降支结扎法〔4〕建立MI大鼠模型，麻醉大鼠后固定在鼠板上，背位固定，大鼠连接小动物呼吸机辅助呼吸，并连接心电图机。大鼠左胸前区第3肋间开胸，肺动脉圆锥与左心耳交界下源1～2 mm处结扎左冠状动脉，迅速止血后逐层缝合，关闭胸腔。MI判断标准为心电图显示2个以上肢体导联或胸导联ST段弓背向上抬高〔5〕。造模过程中死亡4只，2只不符合MI标准，模型成功24只，随机分为MI组、TPG组、TPG+LPA组，每组8只。假手术组8只大鼠除不结扎左冠状动脉外，其余步骤与模型相同。术后3 d腹腔连续注射20万U青霉素防止感染。模型成功后TPG组灌胃54 mg/kg TPG〔6〕，TPG+LPA组灌胃54 mg/kg TPG+腹腔注射RhoA激活剂LPA 10 mg/kg，假手术组、MI组灌胃等体积生理盐水，1次/d、连续4 w。

1.2.2大鼠一般情况 实验结束后，观察大鼠一般情况，包括：精神状态、活动量、进食量、呼吸情况及皮毛情况。

1.2.3全自动生化分析仪检测心肌损伤指标 肌酸激酶同工酶(CK)-MB、心肌肌钙蛋白(cTn)I、cTnT情况立即处死大鼠，心脏采血，立即取出心房和右心室，结扎点下横切2～3 mm置于4%多聚甲醛中固定，紧接着取50 mg新鲜组织备用，其余置于-80℃冰箱备用。血液置于室温放置0.5 h，3 000 r/min离心10 min，上清为血清。全自动生化分析仪检测CK-MB、cTnI、cTnT水平。

1.2.4HE染色观察心肌组织形态学情况 固定于4%多聚甲醛中的组织经乙醇溶液(低浓度-高浓度)脱水，100%乙醇Ⅰ浸泡、100%乙醇Ⅱ浸泡，石蜡包埋、冷冻凝固后切片(厚度：5 μm)。切片脱蜡，乙醇溶液(高浓度-低浓度)复水，滴加苏木素染色、1%盐酸乙醇分化、0.5%伊红染色液染色，乙醇溶液(低浓度-高浓度)脱水，滴加松节油透明、中性树胶封片。光学显微镜下观察并拍照。

1.2.5TUNEL检测心肌组织细胞凋亡情况1.2.4切片按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒方法检测凋亡情况，TUNEL染色可见凋亡细胞显绿色，正常细胞DAPI染色细胞核显蓝色，显微镜下观察并计数。TUNEL染色阳性细胞百分比=TUNEL染色细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6流式细胞术检测心肌组织细胞凋亡情况 新鲜心肌组织用眼科剪剪成肉糜状，磷酸缓冲液反复清洗去除血细胞，胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶1∶1比例消化，消化完全后300目网筛过滤，添加胎牛血清终止消化。1 000 r/min离心10 min，弃上清，磷酸缓冲液反复吹打、清洗细胞，制成心肌细胞单细胞悬浊液。5×106个/ml细胞取100 μl，加5 μl Annexin V-FITC、2 μl碘化丙啶(PI)溶液，避光冰上孵育10 min，加400 μl冰缓冲液，30min内流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况。

1.2.7免疫组化检测大鼠心肌组织中caspase3蛋白表达水平1.2.4切片按HE染色相同方法脱蜡、复水，滴加过氧化氢阻断内源性过氧化氢酶、加热修复抗原，5%脱脂奶粉封片20 min，滴加一抗caspase3(阴性对照用同型同种鼠IgG代替一抗)室温孵育2 h，滴加二抗室温孵育20 min，苏木素染色，盐酸酒精分色，脱水、透明、封片。光学显微镜拍照。caspase3主要表达于细胞核、部分表达于细胞质，阳性染色呈棕黄色。Image J软件分析棕黄色面积，caspase3阳性率=棕黄色面积/分析总面积×100%。

1.2.8Wester印迹检测大鼠心肌组织中RhoA、ROCK蛋白水平 -80℃冰箱中取部分心肌组织，眼科剪剪成肉糜状，冰上研磨，加蛋白裂解液冰上裂解20 min，13 000 r/min 4℃离心20 min，取上清为心肌组织总蛋白。凝胶电泳分离蛋白、PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；添加一抗RhoA、ROCK、GAPDH，4℃孵育过夜；加二抗室温孵育1 h。蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

1.3统计学分析 采用GraphPad8.0软件进行方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。

2 结 果

2.1TPG对大鼠一般情况的影响 假手术组精神、活动等情况均正常；MI组精神萎靡、活动减少、进食减少、呼吸加快，皮毛暗淡无光，脱毛量增加；TPG组与MI组相比精神、活动、进食状态有所缓和，呼吸均匀稍有加快；TPG+LPA组状态与MI组类似。

2.2TPG对大鼠心功能的影响 与假手术组相比，MI组、TPG+LPA组血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平明显升高，TPG组血清中cTnI、cTnT水平明显升高(P<0.05)；与MI组相比，TPG组血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平明显降低，TPG+LPA组血清中cTnI、cTnT水平明显降低(P<0.05)；与TPG组相比，TPG+LPA组血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 TPG对血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平的影响

2.3TPG对大鼠心肌组织形态的影响 假手术组心肌细胞排列整齐，染色均匀；MI组出现大量的心肌细胞坏死、细胞核散落在细胞外现象或细胞核固缩、溶解现象明显，炎症浸润、纤维化现象严重；TPG组心肌细胞坏死现象减少，细胞核固缩、溶解现象缓解；TPG+LPA组心肌细胞症状介于MI组和TPG组之间，出现细胞核散落在细胞外现象，但细胞核固缩、溶解现象不明显，轻微的纤维化现象。见图1。

2.4TUNEL染色检测TPG对大鼠心肌细胞凋亡的影响 与假手术组〔(5.46±0.19)%〕比较，MI组、TPG+LPA组TUNEL阳性细胞比例〔(31.14±3.86)%、(23.48±2.38)%〕明显升高(P<0.05)；与MI组比较，TPG组TUNEL阳性细胞比例〔(12.36±1.39)%〕明显降低(P<0.05)；与TPG组比较，TPG+LPA组TUNEL阳性细胞比例明显升高(P<0.05)。见图2。

2.5流式细胞术检测TPG对大鼠心肌细胞凋亡的影响与假手术组〔(3.15±0.22)%〕相比，MI组、TPG组、TPG+LPA组心肌细胞凋亡比例〔(23.45±1.86)%、(7.49±0.59)%、(15.22±0.38)%〕明显升高(P<0.05)；与MI组比较，TPG组、TPG+LPA组心肌细胞凋亡比例明显降低(P<0.05)；与TPG组比较，TPG+LPA组心肌细胞凋亡比例明显升高(P<0.05)。见图3。

图1 各组心肌组织形态(HE染色，×100)

图2 各组心肌细胞凋亡(×200)

图3 流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡

2.6TPG对心肌组织中caspase3蛋白的影响 与假手术组〔(2.13±0.36)%〕比较，MI组、TPG+LPA组心肌组织中caspase3蛋白阳性率〔(36.49±3.61)%、(26.49±3.12)%〕明显升高(P<0.05)；与MI组比较，TPG组心肌组织中caspase3蛋白阳性率〔(12.16±2.13)%〕明显降低(P<0.05)；与TPG组比较，TPG+LPA组心肌组织中caspase3蛋白阳性率明显升高(P<0.05)。见图4。

2.7TPG对心肌组织中RhoA/ROCK通路蛋白的影响 与假手术组比较，MI组、TPG+LPA组心肌组织中RhoA、ROCK蛋白水平明显升高(P<0.05)；与MI组比较，TPG组心肌组织中RhoA、ROCK蛋白水平明显降低，TPG+LPA组ROCK蛋白水平降低(P<0.05)；与TPG组比较，TPG+LPA组心肌组织中RhoA、ROCK蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图5、表2。

图4 TPG对心肌组织中caspase3蛋白的影响(免疫组化，×400)

图5 TPG对心肌组织中RhoA、ROCK蛋白的影响

表2 TPG对大鼠心肌组织中RhoA、ROCK蛋白的影响

3 讨 论

MI中医论治属“胸痹”“心悸”范畴，《黄帝内经》中记载“心痛病着，胸中痛、胁痛、肩背胛间痛、两臂内痛”即为现代医学中心绞痛、MI，故有“不通则痛”病理论述，与中医描述心阳不足、气滞血瘀、血脉不通机理一致〔7，8〕。赤芍为毛莨科赤芍或川赤芍干燥根，《神农本草经》和历代医籍中均有记载，具有清热解毒、活血祛瘀之功效，在保护心血管、抗血管生成、抗血小板等方面具有重要价值〔9〕。本研究提示，MI大鼠心肌组织出现明显的损伤，破坏严重。经TPG治疗后，精神、活动等现状均有所缓和，心肌组织坏死现象得以缓解。CK-MB、cTnI、cTnT是临床上常见的3种心肌损伤指标，CK-MB正常情况下存在心肌细胞中，在心肌严重损伤时才可被测出，是心肌酶中升高时间最早、幅度最大指标〔10〕。cTnI、cTnT结构不同，cTnI绝大多数存在于心肌细胞中；cTnT表现为不对称结构，正常情况下cTnI、cTnT不会释放入血，当心肌细胞损伤或出现细胞膜通透性增强时，cTnI、cTnT进入细胞间质，进入血液循环〔11,12〕。本研究提示，TPG可以改善MI中心肌细胞损伤情况，实现对疾病的保护。细胞凋亡伴随着细胞增殖、分化、自噬、发育、成熟等过程，参与多种心血管疾病发生、发展，心肌细胞凋亡已成为MI发病的主要机制〔13〕。caspase3被认为是激活各种凋亡刺激因子caspase家族中的关键蛋白酶，可对多种蛋白底物进行降解，从而在细胞凋亡中发挥重要作用〔14〕；减少caspase3水平可减少心肌细胞凋亡，为心肌保护提供参考〔15〕。本研究提示，TPG可以缓解细胞凋亡现象，实现对心肌细胞的保护。Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白成员之一，由RhoA、RhoB、RhoC等亚型组成，目前研究最广泛的是RhoA，起“分子开关”作用〔16〕；ROCK是第一个被证明可影响肌动蛋白组建、细胞骨架重组、张力纤维形成、纤维收缩等多种功能〔17〕。在MI中RhoA/ROCK通路处于激活状态，参与动脉粥样硬化、血管平滑肌收缩、内皮细胞黏附、炎症反应、巨噬细胞分化、氧化应激和细胞凋亡等过程〔18,19〕。ROCK可直接裂解caspase3的底物，在心肌中高表达又可激活caspase3，在病理条件下ROCK与caspase3二者正反馈调节，促进心肌细胞凋亡级联反应，形成恶性循环，加重疾病〔20〕。本研究提示，MI中RhoA/ROCK通路处于激活状态，可导致生成caspase3底物裂解，同时激活caspase3，加重心肌细胞凋亡；与MI组相比，TPG组心肌组织中RhoA/ROCK通路被抑制，从而缓解细胞凋亡过程。在TPG的基础上添加RhoA激活剂LPA后可逆转TPG对MI心肌细胞凋亡的缓解。