miR-187-3p调控FOXK1/NF-κB信号通路影响破骨细胞增殖、凋亡及分化的分子机制

张涛 杨扉扉 王藜篥 黄华 张松 曹永飞

(贵州省骨科医院骨外科，贵州 贵阳 550002)

骨质疏松(OP)的主要特征为骨代谢增加、骨密度降低等，常发生于绝经后妇女中，已成为影响绝经后妇女生活质量的重要问题，大部分患者在骨折发生后被确诊为OP，因而早期诊断及治疗成为提高患者生活质量的重要途径〔1,2〕。微小RNA(miRNA)广泛存在于机体中表达异常与骨代谢异常密切相关，并可能作为诊断OP的重要辅助指标〔3〕。miR-187-3p表达水平升高可抑制大麻素受体2型(CNR2)对成骨细胞前体细胞成骨分化的抑制作用〔4〕。靶基因预测显示miR-187-3p与叉头框转录因子(FOX)K1存在结合位点，研究表明抑制FOXK1表达可通过抑制糖酵解作用而抑制肝癌细胞增殖〔5〕。原花青素通过抑制核因子(NF)-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路而抑制OP破骨细胞的形成和功能〔6〕。本研究探讨miR-187-3p对破骨细胞增殖、凋亡、分化的影响及其对FOXK1/NF-κB信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1一般资料 选取贵州省骨科医院2018年2月至2020年9月收治的49例绝经后OP性骨折患者为OP组，所有患者符合世界卫生组织在2004年颁布的OP诊断标准，年龄63～75岁，平均(68.24±5.61)岁，体重(62.31±6.29)kg，身高(156.32±5.62)cm，体重指数(BMI，26.16±3.16)kg/m2。同时选取绝经后OP无骨折患者49例为control组，年龄65～78岁，平均(69.34±3.24)岁，体重(61.35±5.24)kg，身高(155.49±6.32)cm，BMI(26.35±3.21)kg/m2。两组年龄、体重、身高、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。所有研究对象于清晨抽取患者空腹外周静脉血，室温静置5 min后经3 000 r/min转速离心10 min，吸取上清液置于-20℃冰箱内保存。

1.1.2主要试剂 南京君科生物提供18只SPF级雌性大鼠，动物合格证号：SYXK(宁)：2016-0020，体重(184.16±23.16)g，8周龄。美国Invitrogen提供Lipofectamine2000、Trizol试剂；北京天根生化提供反转录与荧光定量PCR试剂；广州锐博生物提供miR-NC、miR-187-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-187-3p；武汉淼灵生物提供pcDNA；北京索莱宝提供噻唑蓝(MTT)试剂、细胞凋亡检测试剂盒；美国CST提供兔抗鼠Ki-67、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3抗体；北京百奥莱博提供兔抗鼠p-p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IкBα)抗体。

1.2方法

1.2.1建立OP大鼠模型与分离大鼠破骨细胞 采用随机分组的方法分为正常组与模型组，每组9只。模型组禁食12 h，肌肉注射0.5 g阿托品，采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，消毒后在大鼠背部正中切口，切除大鼠肋缘下侧的双侧卵巢，缝合切口后采用无菌纱布与油纱双层敷料覆盖创面、包扎，通过检测大鼠的血、尿、骨骼参数判断造模是否成功〔7〕。两组颈椎脱位处死后，采用乙醇浸泡消毒，采取大鼠两侧股骨、胫骨，取周围软骨组织后切除两端骨骺，骨髓腔暴露，采用50 ml α-MEM培养液与1 ml青霉素-链霉素溶液清洗骨髓腔直至骨面变白，轻轻吹打提取液，细胞计数，经25 000 r/min离心8 min后，加入10 ml α-MEM培养液制备单细胞悬液〔8〕。

1.2.2实验分组 在10%胎牛血清、100 U/ml青霉素与100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中接种破骨细胞，使细胞在培养箱中继续培养，一直到细胞能生长融合达到80%，之后开展传代培养。于96孔板(100 μl/孔)接种对数生长期破骨细胞(2.5×105个/ml)，分别将miR-NC、miR-187-3p mimics、pcDNA-NC、pcDNA-FOXK1、miR-187-3p mimics与pcDNA-NC、miR-187-3p mimics与pcDNA-FOXK1转染入破骨细胞，分别记为miR-NC组、miR-187-3p组、pcDNA-NC组、pcDNA-FOXK1组、miR-187-3p+pcDNA-NC组、miR-187-3p+pcDNA-FOXK1组。同时将正常培养的细胞作为NC组。

1.2.3实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-187-3p与FOXK1、耐酒石酸酸性磷酸酶(Acp)-5、基质金属蛋白酶(MMP)9、组织蛋白酶(Cathepsin)K、整合素(Integrinαv)mRNA 的表达水平 针对control组、OP组的血清、各种破骨细胞总RNA均经过Trizol法提取，以反转录方法合成cRNA，并开展qRT-PCR扩增。之后进行荧光定量PCR方法对基因的相对表达量作出检测。

1.2.4MTT检测细胞增殖 将各组的破骨细胞接种在96孔板上，并且在每孔中均加入20 μl MTT溶液，然后放置在体积分数为5%的二氧化碳培养箱当中，设置温度为37℃，持续培养4 h，取上清液，之后每孔再加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，在温室作用之下震荡孵育5 min，再以酶标仪将各孔的吸光度值做出标准检测。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率 每组的破骨细胞内均需要将胰蛋白酶(0.25%浓度)加入促进消化，以凋亡测试试剂盒的说明书为依据进行严格的检测。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测miR-187-3p与FOXK1的靶向关系 将miR-NC、miR-187-3p mimics分别同野生型载体WT-FOXK1与突变型载体MUT-FOXK1共同转入到破骨细胞，之后常规培养24 h，然后开展荧光测试，利用荧光素酶活性对细胞进行测定，分析结果。

1.2.7Western印迹检测FOXK1、Ki-67、Cleaved-caspase-3、p-p65、p-IкBα蛋白表达 所有组的破骨细胞均以500 μl的放射免疫沉淀(RIPA)裂解液实施细胞提取，得到细胞总蛋白，将所获取的细胞总蛋白样品选择50 μl加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)开展电泳反映，使蛋白分离。之后在密闭环境下停放2 h，将1∶1 000的一抗稀释液加入，将辅浴箱温度设置为4℃，放入其中孵育24 h。对经过TBST洗涤以后的样品再加入1∶2 000的二抗稀释液,然后采用ImageJ软件为各个条带灰度值作出分析。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1OP性骨折患者血清中miR-187-3p和FOXK1的表达水平 与control组比较，OP组血清中miR-187-3p表达水平明显降低，FOXK1 mRNA及蛋白水平明显升高(均P<0.05)，见图1、表1。

图1 Western印迹检测人血清中FOXK1蛋白表达

表1 OP骨折患者血清中miR-187-3p和FOXK1表达水平

2.2OP大鼠模型破骨细胞中miR-187-3p和FOXK1表达情况 与正常组比较，模型组miR-187-3p表达水平明显降低，FOXK1 mRNA及蛋白水平明显升高(P<0.05)，见图2、表2。

图2 Western印迹检测破骨细胞FOXK1蛋白表达

表2 破骨细胞中FOXK1和miR-187-3p表达量

2.3高表达miR-187-3p抑制破骨细胞活性和分化，促进细胞凋亡 与miR-NC组比较，miR-187-3p组细胞活力明显降低，细胞凋亡率明显升高，Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv mRNA表达水平明显降低，miR-187-3p、Cleaved-caspase-3蛋白水平明显升高(均P<0.05)，见图3、表3。

2.4高表达FOXK1促进破骨细胞活性和分化，抑制细胞凋亡 与pcDNA-NC组比较，pcDNA-FOXK1组细胞活力明显明显升高，细胞凋亡率明显降低，FOXK1、Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv mRNA表达水平明显升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，见表4、图4。

图3 高表达miR-187-3p抑制破骨细胞活性和分化，促进细胞凋亡

表3 高表达miR-187-3p抑制破骨细胞活性和分化，促进细胞凋亡

图4 高表达FOXK1对破骨细胞活性、分化细胞凋亡的影响

表4 高表达FOXK1对破骨细胞活性、分化、抑制细胞凋亡的影响

2.5miR-187-3p靶向表达FOXK1 starbase预测显示miR-187-3p和FOXK1存在结合位点，见图5。miR-187-3p过表达可明显降低野生型载体WT-FOXK1的荧光素酶活性(P<0.05)，见表5。miR-NC组FOXK1蛋白表达为(0.92±0.09)，miR-187-3p组为(0.43±0.04)，anti-miR-NC组为(0.94±0.08)，anti-miR-187-3p组为(1.37±0.13)。与miR-NC组、anti-miR-NC组比较，miR-187-3p过表达可抑制FOXK1表达，抑制miR-187-3p表达可促进FOXK1表达(P<0.05)，见图6。

图5 通过starbase对miR-187-3p和FOXK1结合进行预测示意图

表5 miR-NC或 FOXK1与报告质粒共转染MC3T3-E1细胞后双荧光素酶活性检测

1～5:miR-NC组，miR-187-3p组，anti-miR-NC组，anti-miR-187-3p组图6 Western印迹检测4组FOXK1蛋白表达

2.6FOXK1高表达可以逆转miR-187-3p高表达对破骨细胞增殖、凋亡、分化的影响 与miR-187-3p+pcDNA-NC组比较，miR-187-3p+pcDNA-FOXK1组细胞活力明显升高，细胞凋亡率明显降低，Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv的表达水平明显升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平明显降低(P<0.05)，见图7、图8、表6。

图7 流式细胞仪检测细胞凋亡

1，2：miR-187-3p+pcDNA-NC组,miR-187-3p+pcDNA-FOXK1组图8 Western印迹检测FOXK1、Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表6 FOXK1高表达可以逆转miR-187-3p高表达对破骨细胞增殖、凋亡、分化的影响

2.7NF-κB信号通路蛋白表达 与NC组比较，miR-187-3p组p-p65、p-IкBα蛋白水平明显降低(P<0.05)，pcDNA-FOXK1组p-p65、p-IкBα蛋白水平明显升高(P<0.05)；与miR-187-3p+pcDNA-NC组比较，miR-187-3p+pcDNA-FOXK1组p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(P<0.05)，见图9、表7。

1～6:NC组,miR-NC组,miR-187-3p组,pcDNA-FOXK1组, miR-187-3p+pcDNA-NC组,miR-187-3p+pcDNA-FOXK1组图9 Western印迹检测p-p65、p-IкBα蛋白的表达

表7 各组NF-κB信号通路蛋白的表达

3 讨 论

miRNA在OP中表达异常，并可能参与OP发生及发展过程，骨吸收性骨细胞、骨形成性成骨细胞与骨骼修复密切相关，破骨细胞分化过程与破骨细胞前体表达的NF-κB密切相关，既往研究显示，miR-133a通过促进破骨细胞分化参与绝经后OP发生过程〔9〕。miR-29a通过调节PCAF介导的RANKL和CXCL12而抑制破骨细胞的形成并预防OP〔10〕。miR-483-5p通过促进破骨细胞分化参与OP的发病过程〔11〕。

miR-187-3p过表达通过抑制IL-1β释放而减轻缺血再灌注损伤〔12〕。LncRNA PVT1通过靶向miR-187-3p/AGO1轴促进阿霉素诱导的心肌细胞凋亡〔13〕。研究表明Ki-67与细胞增殖有关，其水平升高表示细胞增殖能力增强〔14〕。本研究结果提示，miR-187-3p过表达可抑制破骨细胞增殖。caspase级联反应激活可诱导细胞凋亡〔15〕。本研究结果显示，miR-187-3p过表达可促进破骨细胞凋亡。Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv基因与破骨细胞分化密切相关，其表达水平升高表示细胞分化能力增强〔16,17〕。本研究结果提示，miR-187-3p过表达可抑制破骨细胞分化。

本研究证实FOXK1是miR-187-3p的靶基因，miR-187-3p可负向调控FOXK1的表达。研究表明miR-186-5p通过靶向FOXK1在人骨肉瘤中发挥抑癌作用〔18〕。甘草酸通过调节NF-κB、ERK和JNK信号通路抑制破骨细胞分化〔19〕。NF-κB信号通路被激活后可促进破骨细胞形成〔20〕。本研究结果提示miR-187-3p过表达可能通过调控FOXK1/NF-κB信号通路而发挥作用。