微热辅助低温等离子体杀菌技术对榨菜贮藏期品质劣变的影响

赵 楠，葛黎红，张恺熹，黄玉立，，侯新磊，梅 源，曾雪晴，王艳丽，彭灯水，颜正财，章建浩

（1.南京农业大学 食品科学技术学院，江苏 南京 210095；2.四川省农业科学院 农产品加工研究所，四川 成都 610066；3.四川师范大学 生命科学学院，四川 成都 610101；4.吉香居食品股份有限公司，四川 眉山 620039）

榨菜作为世界三大酱菜之一，因其爽脆鲜香的独特感官品质深受国内外消费者喜爱[1]。榨菜的制作工艺是腌渍发酵的典型代表，干腌过程形成的高渗环境有效抑制了腐败菌，使得乳酸菌和真菌成为优势微生物[2-4]。榨菜发酵完成后经包装进入贮藏销售环节，在物流过程中，乳酸菌的后发酵作用常引起发酵体系过酸问题，而真菌则会消耗还原糖和有机酸产生大量气体并形成膜璞，极易引起包装后产品的胀袋和膜璞腐败，最终导致产品感官品质与安全属性的同时劣化[5-6]。因此，开发针对榨菜包装产品的广谱性有效杀菌技术对产品规模化生产与扩大化销售具有重要作用。

发酵蔬菜产业目前常用的杀菌方式是以巴氏杀菌为代表的热杀菌，辅以防腐剂的添加以达到抑菌目的。但热强度常常导致榨菜出现质构软烂、益生性下降等品质问题，添加剂的使用也大大降低了产品的消费者接受度[7]。近年来低温等离子体杀菌（cold plasma sterilization，CPS）技术的出现为解决以上问题提供了新思路[8]。该技术是通过高压电场产生的介质阻挡放电效应进行食品冷杀菌的新型方式，具有安全、无污染、热效应低的特点[9]。CPS应用于发酵蔬菜时，可杀灭包装泡菜中的产气真菌，并减少产膜真菌数量，但对乳酸菌的后酸化作用影响较小[10]。同时，放电效应产生的臭氧也在不同程度上加速了产品色泽褐变与暗淡。微热辅助低温等离子体技术（mild heating-assisted cold plasma sterilization，MH-CPS）是将微热与CPS结合，该技术通过采用低于巴氏杀菌的温度（50～60 ℃）与低温等离子体结合对食品进行处理，可在强化杀菌效果的同时，弱化放电效应引起的色泽劣化[11-12]。已有研究发现，相比于巴氏杀菌和CPS单独处理时，微热辅助介质电场处理对包装果蔬汁、果蔬干粉、鲜切果蔬制品中大肠杆菌[13]、单增李斯特菌[14]以及蜡样芽孢杆菌[12]等致病菌具有更高杀菌率，且对产品感官品质的破坏作用更小[15-17]。目前，有关MH-CPS杀菌技术在发酵食品中的应用仅限于发酵乳制品领域，该技术在奶酪杀菌时可有效减缓质地结块和色泽褐变现象[18-19]。而MH-CPS在发酵蔬菜包装产品中的杀菌效果及其对产品贮藏过程中品质的影响还不明确。

因此，本研究以MH-CPS处理包装榨菜样品，通过与未杀菌（对照）、微热杀菌（mild-heating strilization，MHS）、CPS、巴氏杀菌样品作比较，分析榨菜经不同杀菌方式处理后，在贮藏过程中的理化特性、微生物数量、质构色泽品质变化及腐败进程，以期为开发适用于包装榨菜产品的高效杀菌方式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜脱盐榨菜（食盐含量为3 g/100 g，总酸含量为0.25 g/100 g）：吉香居食品股份有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、MRS培养基、孟加拉红琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：青岛海博生物技术有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

CPS-I型低温等离子体灭菌系统：南京润屹有限公司；2GN-75-K型包装机：浙江利强包装科技公司；TAXTPlus质构仪：英国Stable Micro System公司；S210SevenCompactTM型pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榨菜的制备与杀菌

将榨菜切为8 mm×8 mm×15 mm大小的样品置于包装盒中密封，随机分为五组。第一组不经杀菌处理，记为对照组；第二组采用巴氏杀菌（80 ℃水浴30 min）处理，记为巴氏杀菌组；第三组采用CPS系统进行杀菌，杀菌参数为：电压140 kV，频率50 Hz，时间12 min，记为CPS组；第四组采用微热（55 ℃水浴15 min）杀菌，记为MHS组；第五组采用MH-CPS杀菌，样品先进行微热处理再进行CPS处理，记为MH-CPS组。采用高于常规贮藏温度条件进行加速贮藏实验，将杀菌后样品置于37 ℃避光贮藏，在0、2 d、4 d、6 d分别取样进行指标测定。

1.3.2 理化指标的测定

（1）pH和总酸的测定[8]

取样品3 g与27 mL去离子水混合、均质，采用pH计测定pH。取样品10 g与20 mL超纯水混合、超声提取10 min，过滤得上清液采用0.1 mol/L NaOH滴定，以乳酸为标准物质进行计算，结果以g/100 g表示。

（2）还原糖含量的测定[8]

取榨菜样品10 g与20 mL超纯水混合、超声提取10 min，过滤得上清液，取2 mL上清液与1.5 mL 3,5-二硝基水杨酸混匀后于沸水中保温5 min，于波长540 nm处测定吸光度值。以葡萄糖为标准物质绘制标准曲线，按照标准曲线回归方程进行还原糖含量计算，结果以g/100 g表示。

（3）亚硝酸盐含量的测定[10]

取切碎5 g样品与12.5 mL饱和硼砂溶液、480 mL 70 ℃去离子水混合，于沸水浴中提取15 min，冷却后取上清液与5 mL亚铁氰化钾和5 mL乙酸锌溶液分别混合，过滤得上清液。上清液中先后加入2 mL氨基苯磺酸溶液和1 mL盐酸萘乙二胺溶液，15 min后于波长538 nm处测定吸光值。以亚硝酸钠为标准物质绘制标准曲线，按照标准曲线回归方程进行亚硝酸盐含量计算，结果以mg/kg表示。

（4）氨基酸态氮含量的测定[10]

取切碎2 g样品与15 mL超纯水混合、超声提取10 min，过滤得上清液，先加入0.1 mol/L NaOH将其pH调至8.2，而后加入10 mL甲醛，充分混匀后采用0.1 mol/L NaOH将混合物pH滴定至9.2，氨基酸态氮含量计算公式如下：

式中：M为NaOH浓度，mol/L；V为滴定NaOH消耗量，mL；W为样品质量，g；0.014是代表N元素的毫摩尔分子量，g/mmol。

（5）质构剖面分析[10]

采用质构分析仪，选用P36探头，在TPA模式下，测前、测试、测后速度分别为1 mm/s、1 mm/s、2 mm/s，压缩比例50%。记录仪器反馈的硬度、咀嚼性数据。

1.3.3 微生物指标的测定

细菌、乳酸菌、真菌的计数参照文献[8]。在无菌条件下，将5 g样品与25 mL无菌生理盐水混合、均质，适度稀释后分别涂布于PCA培养基平板、MRS琼脂培养基平板和孟加拉红琼脂培养基平板上。PCA培养基用于细菌总数计数，培养条件：30 ℃，72 h；MRS琼脂培养基用于乳酸菌计数，培养条件：30 ℃厌氧，72 h；孟加拉红琼脂培养基用于真菌计数，培养条件：（28±2）℃，48 h。产膜真菌计数参照现有方法[8]。挑取孟加拉红琼脂培养基平板上的菌落，分别接种于YPD液体培养基上，于（28±2）℃培养48 h后观察YPD液体培养基表面膜璞产生情况，若YPD液体培养基表面有膜璞漂浮，则判定该菌落为产膜真菌，计入产膜真菌数量。

1.3.4 数据分析

除质构采用8组平行外，其余指标均采用3组平行，数据结果表示为“平均值±标准差”。采用SPSS 26.0软件分析数据之间的差异显著性，显著性分析水平选取P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌方式对榨菜贮藏期色泽及腐败进程的影响

外观可直接反映包装榨菜在贮藏过程中色泽变化及微生物腐败的进程，经不同杀菌处理的榨菜在贮藏前后色泽变化及腐败情况结果见图1。由图1可知，与对照组相比，刚完成杀菌的榨菜中CPS组、MHS组和MH-CPS组均较好地保持了新鲜榨菜的外青内赭色泽，而巴氏杀菌组略微泛白且失去光泽。贮藏过程使得榨菜色泽褐变，且表面可见白色膜璞，这与产膜真菌大量繁殖有关[6]。在贮藏6 d后，对照组样品褐变严重，膜璞也积累最多，CPS和MHS组均有少量膜璞产生。MH-CPS组和巴氏杀菌组在贮藏完成后仍无膜璞生成，且MH-CPS组在贮藏全程维持了较好的榨菜色泽。这表明MH-CPS组不仅可有效抑制榨菜在贮藏过程中膜璞腐败的发生，还可在一定程度上缓解色泽褐变。

图1 经不同杀菌处理的榨菜在贮藏前后的色泽变化及腐败情况Fig.1 Color changes and spoilage of Zhacai after sterilization by different treatments during storage

2.2 不同杀菌方式对榨菜贮藏期还原糖含量的影响

还原糖是榨菜中微生物的主要碳源物质，不同杀菌处理的榨菜在贮藏过程中的还原糖含量变化见图2。由图2可知，榨菜经杀菌处理后，还原糖含量在贮藏期间均逐渐上升，源于微生物水解蔬菜组织多糖产生的还原糖[20]，由于微生物生长受限代谢减弱，还原糖溶出速度大于消耗速度，导致还原糖积累[10，21]。贮藏6 d后MH-CPS组和巴氏杀菌组还原糖含量均较大，说明这两种杀菌条件下的后发酵和腐败作用均受到明显抑制。

图2 不同杀菌处理对榨菜贮藏期还原糖含量的影响Fig.2 Effect of different sterilization treatments on reducing sugar contents of Zhacai during storage

2.3 不同杀菌方式对榨菜贮藏期总酸和pH的影响

总酸和pH可反映榨菜贮藏期间的后发酵作用，不同杀菌处理的榨菜在贮藏过程中的pH及总酸含量变化见图3。

图3 不同杀菌处理对榨菜贮藏期pH（A）和总酸含量（B）的影响Fig.3 Effect of different sterilization treatments on pH (A) and total acid contents (B) of Zhacai during storage

由图3可知，在贮藏过程中，对照组pH高于其他组，MHS组样品在贮藏期间略有上升。而CPS、MH-CPS组、巴氏杀菌组榨菜在贮藏期pH无明显变化。这与对照组总酸含量在贮藏前期显著下降的情况相对应。这可能是由于膜璞腐败真菌消耗有机酸，导致总酸下降而pH上升[22]。杀菌后样品在贮藏后总酸均有所增加，说明后发酵作用维持了包装榨菜在贮藏过程的酸度状态。在贮藏6 d时，CPS、MHS组、MH-CPS组、巴氏杀菌组的总酸含量分别增加了16%、19%、26%和8%。根据总酸和pH结果可知，微热与CPS单独或联合处理均有助于维持榨菜的酸性环境。

2.4 不同杀菌方式对榨菜贮藏期微生物数量的影响

不同杀菌处理的榨菜在贮藏过程中的菌落数量变化见图4。

图4 不同杀菌处理对榨菜贮藏期细菌（A）、乳酸菌（B）、真菌（C）和产膜真菌（D）数量的影响Fig.4 Effect of different sterilization treatments on bacteria (A),lactic acid bacteria (B),fungi (C) and film-producing fungi (D) of Zhacai during storage

由图4可知，榨菜贮藏期间细菌和乳酸菌数量无明显差别，说明乳酸菌是样品中的主要细菌。MHS和CPS单独处理均对细菌和乳酸菌无明显减菌作用。MH-CPS处理使得起始细菌和乳酸菌数量分别降低了1.9 lg（CFU/g）和1.6 lg（CFU/g），在贮藏期间细菌和乳酸菌继续减少，最终细菌和乳酸菌数量分别比未杀菌榨菜低2.8 lg（CFU/g）和2.6 lg（CFU/g）。这得益于CPS的后杀菌效应，即在贮藏过程中，放电介质产生的气体继续杀灭微生物[23]。巴氏杀菌的即时杀菌效应主要表现在将初始菌数量大幅度削减了3.9 lg（CFU/g），但对乳酸菌的繁殖代谢影响不大，因而乳酸菌数量在贮藏2 d后迅速上升。对于真菌，微热或CPS处理杀菌效果有限，很难完全杀灭真菌。研究显示CPS单独处理对泡萝卜中乳酸菌破坏作用不大，而对产气真菌具有较好杀菌效果[10]，与本研究结果不同，说明CPS的杀菌效果因产品而异。对照组榨菜在贮藏期间有大量产膜真菌繁殖，各杀菌方式均实现了贮藏全程无产膜真菌生长的杀菌作用，但CPS、MHS和巴氏杀菌均无法有效抑制细菌和乳酸菌的增殖。MH-CPS组实现了贮藏全程无真菌状态，同时有效抑制细菌和乳酸菌的增殖，达到了比巴氏杀菌更佳的效果。

2.5 不同杀菌方式对榨菜贮藏期质构品质的影响

榨菜硬度与咀嚼性的同时下降表现为易碎、无嚼劲的不良感官体验。不同杀菌处理的榨菜在贮藏过程中的硬度和咀嚼性数量变化见图5。

图5 不同杀菌处理对榨菜贮藏期硬度（A）和咀嚼性（B）的影响Fig.5 Effect of different sterilization treatments on hardness (A) and chewiness (B) of Zhacai during storage

由图5可知，随着贮藏时间延长，硬度和咀嚼性都随之下降，巴氏杀菌组榨菜在贮藏后质构劣化最为严重，可能是由于热效应下细胞壁果胶溶出，引起植物组织机械强度下降[24]。MHS或CPS单独处理也可减缓质构劣化，两者结合可实现最佳的质构提升效果，贮藏6 d后榨菜硬度和咀嚼性比巴氏杀菌组分别提升了34%和44%。在蔬菜发酵过程中，一方面，真菌产生的酶类可降解植物组织化学组分；另一方面，内生菌将侵入植物细胞内部，直接形成物理性破坏，这些过程均可导致质构软烂[25]。研究表明CPS处理可通过杀菌钝酶作用提升鲜切果蔬的质构品质[26]。微热作用可在不溶解细胞壁果胶的前提下，钝化细胞壁降解酶类，从而维持植物组织完整度[24]。对物理性与化学性破坏的多效抑制作用使得MH-CPS处理法表现出了更佳的质构改善效果。

2.6 不同杀菌方式对榨菜贮藏期亚硝酸盐含量的影响

亚硝酸盐是榨菜中常见的食品安全危害因素，不同杀菌处理的榨菜在贮藏过程中的亚硝酸盐和氨基酸态氮含量变化见图6。

图6 不同杀菌处理对榨菜贮藏期亚硝酸盐含量（A）和氨基酸态氮含量（B）的影响Fig.6 Effect of different sterilization treatments on nitrite contents (A)and amino nitrogen contents (B) of Zhacai during storage

由图6A可知，对照组亚硝酸盐含量在贮藏6 d后较初始值增加了1.84倍。CPS组亚硝酸盐在贮藏结束时增加了29%，高于其他组，这可能是由于CPS放电过程产生的氮氧化物为亚硝酸盐生成提供了原料[10]。MHS组、MH-CPS组和巴氏杀菌组的亚硝酸盐含量在整个贮藏过程中无明显变化。氨基酸态氮是亚硝酸盐的前体物质，由蛋白降解产生，可指示亚硝酸盐的潜在生成风险。由图6B可知，巴氏杀菌组和MH-CPS组氨基态氮含量在整个贮藏进程中无明显变化，其他组均增长20%～30%。由于真菌是发酵蔬菜中产生蛋白酶的主要微生物[27]，MH-CPS以及巴氏杀菌对氨基态氮积累的抑制也与其对真菌的有效杀灭作用有关。

3 结论

相较于CPS和MHS处理，MH-CPS表现出了更优越的杀菌效果，可完全杀灭榨菜中的真菌尤其是产膜真菌，并大幅度降低细菌和乳酸菌数量，有效减缓产品的膜璞腐败现象，在稳定理化性质的同时，抑制亚硝酸盐和氨基态氮积累；与巴氏杀菌的热处理破坏作用相比，MH-CPS还具有减缓榨菜硬度、咀嚼性劣化并保持色泽的优势。因此，MH-CPS处理发酵蔬菜具有改善贮藏稳定性的潜力。