超声辅助一锅法去除牛骨胶原蛋白肽粉异嗅味物质研究

刘 浩 强 宇 张鸿儒 刘俊梅 韩 东 徐 杨 张春晖，*

（1宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750000；2中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；3内蒙古蒙肽生物工程有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010）

牛是我国珍贵的畜种资源，牛骨中含有丰富的胶原蛋白。研究表明，补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性，促进钙盐有序沉积，增加骨密度和骨强度［1-3］。牛骨胶原蛋白肽是以牛骨为原料，在酸、碱、热处理或酶解的作用下得到的产物［4］，然而其高值化加工过程中易产生令人不悦的异嗅味，严重制约了该产业的发展。

食品异嗅味脱除的方法主要有物理法［5］、生物法［6］、化学法［7］。其中，物理方法是通过活性炭吸附、外源物质遮盖和微胶囊包埋达到部分异味的去除，操作相对复杂且耗时［8-9］；生物法是依据微生物的代谢使异味化合物转变成无味的物质，常被利用在发酵领域，酶法虽然安全、清洁，但催化效率相对较低［10-11］；化学法是通过美拉德反应、酸碱盐处理和加入氧化剂来使得异嗅味消失［12］，从而改善食品的品质，该方法可控、操作简单，可以有效脱除异嗅味。

研究表明，可利用超声波在液体介质中的空化作用提高液体化学反应速度和产率［13］，但将超声波法应用于牛骨胶原蛋白肽除臭的研究较少。本试验利用气相色谱-质谱法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）结合相对香气活性值检测出异嗅味物质（脂肪酸）后，借助超声波辅助氢氧化钙催化异嗅味物质与乙醇发生酯化反应，使其生成易挥发的酯类物质。此反应中氢氧化钙既可做为酯化反应的催化剂，也可以用来调节肽粉溶液pH值，达到一锅法除去肽粉异嗅味物质并调节其pH值的目的，以期为牛骨胶原蛋白肽粉脱臭工艺和工业化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

异嗅味牛骨胶原蛋白肽粉，内蒙古蒙肽生物工程有限公司；2-甲基-3-庚酮，北京润泽康生物科技有限公司；C7-C40 正构烷烃混标，北京佰凯生物科技有限公司；氢氧化钙（分析纯）、福林酚，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯），北京市通广精细化工公司；牛血清蛋白质标准溶液，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010Plus 气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；KQ-500B 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司；FE20梅勒特-托利多pH 计，瑞士梅勒特-托利多仪器有限公司；T6 紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；电子眼，英国Verivide DigiEy 公司；H-Spray Mini 喷雾干燥仪，北京霍尔斯生物科技有限公司；MS-H340-S4LCD 数控加热型四通道磁力搅拌器，大龙兴创实验仪器（北京）股份有限公司；50/30 μm 二烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）2 cm 固相微萃取头，美国Supelco 公司；20 mL 顶空采样瓶，北京广达恒益科技有限公司；其他常规仪器设备由中国农业科学院农产品加工研究所提供。

1.3 试验方法

1.3.1 顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）条件 取2 g 牛骨胶原蛋白肽粉置于20 mL 顶空瓶，添加1.5 μL 1.68 μg·μL-1的2-甲基-3-庚酮作为内标，密封顶空瓶，采用50/30 μm二烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）2 cm固相微萃取头，以萃取温度37 ℃、平衡时间20 min、萃取时间40 min为条件进行萃取，使顶空瓶中的挥发性物质达到平衡状态，气相色谱（gas chromatography，GC）自动进样，解析温度240 ℃，解析5 min。

1.3.2 GC-MS条件 GC条件：色谱柱为CD-WAX弹性石英毛细管（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为氦气（99.999%），流速为1.0 mL·min-1；进样口温度为240 ℃；不分流进样。升温程序：柱温38 ℃，保持13 min，以3 ℃·min-1升温至100 ℃，保持5 min，以4 ℃·min-1升温至150 ℃，以10 ℃·min-1升温至240 ℃。

质谱（mass spectrometry，MS）条件：离子源温度200 ℃；电子能量70 eV；发射电流150 μA；倍增电压1 037 V；接口温度220 ℃；质量扫描范围35～450 m/z；电离方式为电子电离（electron ionization，EI）。

1.3.3 GC-MS 定性及定量分析 GC-MS 定性分析：将检测到的挥发性物质图谱与NIST17 标准谱库进行对比并初步鉴定，然后采用与样品分析相同的色谱条件，以C7～C30 正构烷烃作为标准，计算挥发性化合物的保留指数，最后结合保留指数确定化合物［14］。保留指数计算公式［15-17］如下：

式中，I：保留指数；n：碳数；t：待测挥发性成分的保留时间，min；tn：具有n个碳原子的正构烷烃的保留时间，min；tn+1：具有n+1个碳原子的正构烷烃的保留时间，min。

GC-MS 定量分析：采用内标法定量［18］。内标法定量计算公式如下：

式中，C：测得挥发性物质浓度，μg·kg-1；p1：测得挥发性物质峰面积；m2：加入的内标化合物质量，μg；p2：测得内标化合物峰面积；m1：萃取时加入顶空瓶中肽粉质量，kg。

1.3.4 ROAV 法鉴定异嗅味肽粉中特征气味成分相对香气活性值（relative aroma activity value，ROAV）计算公式如下：

式中，C：测得挥发性物质浓度，μg·kg-1；OT：测得挥发性物质在水中的气味阈值，μg·kg-1。

ROAV 可以用来评测某挥发性物质对整体风味的贡献值，ROAV 越大，该挥发性物质对整体风味贡献值越大。当ROAV≥1时，认为其为关键风味化合物，对整体风味具有重要的贡献作用；当0.1≤ROAV＜1 时，认为其对样品整体风味也具有一定的贡献作用［19-21］。

1.3.5 感官评价 以滋味、气味为感官评价指标，其中滋味的权重为20%，气味的权重为80%［12］。邀请12名嗅觉功能正常、不吸烟且品评期间无感冒、鼻塞等干扰嗅闻状况的受试者组成感官评价小组，包括6名男性，6名女性，年龄分布在22岁至26岁之间，均来自中国农业科学院农产品加工研究所，经过感官评价训练后对肽粉进行评价，满分为100分，感官评分标准［22］见表1。

表1 肽粉感官评分标准Table 1 Sensory scoring standard of peptide powder

1.3.6 肽保留率 肽可与福林酚试剂反应，生成蓝色复合物，颜色的深浅与肽含量成正比，采用福林-酚法测定肽含量［23］。按照公式计算肽保留率：

1.3.7 酯化反应脱臭单因素试验 将肽粉与去离子水配制成浓度为0.2 g·mL-1的溶液，取200 mL 溶液于带橡胶塞的300 mL 锥形瓶中，在超声水浴锅中加热至80 ℃，用氢氧化钙调节pH 值至10，加入2%乙醇反应30 min，通过喷雾干燥法使其干燥为粉末状，最后以感官评分、肽保留率为响应指标，采用单因素轮换法［24-25］，以三因素五水平依次考察乙醇添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、反应温度（60、70、80、90、100 ℃）、反应时间（10、20、30、40、50 min）对骨胶原蛋白肽粉异嗅味的影响。反应初始条件为乙醇添加量2%、温度80 ℃、时间30 min。因素水平见表2。

表2 化学反应脱臭法因素水平表Table 2 Factor level table of chemical reaction deodorization method

1.3.8 喷雾干燥条件 设置进风风量为90%，进风温度为160 ℃，进料速率为10 mL·min-1，通针300 s，干燥结束后得到粉末状脱臭后牛骨胶原蛋白肽粉［26-27］。

1.3.9 酯化反应脱臭响应面试验 在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken 试验设计与分析［28-29］进行三因素三水平响应面优化试验，利用Design Expert 10 软件对回归方程进行逐步回归，以感官评价得分作为响应值确定最佳脱臭工艺条件。

1.3.10 脱臭前后牛骨胶原蛋白肽粉品质指标测定总氮的测定参考《GB 5009.5-2016食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》［30］。灰分的测定参考《GB 5009.4-2016食品安全国家标准 食品中灰分的测定》［31］。水分的测定参考《GB 5009.3-2016食品安全国家标准 食品中水分的测定》［32］。脱臭前后牛骨胶原蛋白肽粉水溶性指数变化的测定方法如下：精确称取脱臭前后牛骨胶原蛋白肽粉为m1，放入200 mL 烧杯中，分别加入100 mL蒸馏水，搅拌均匀，在60 ℃水浴锅中静置30 min，再于500 r·min-1下离心15 min，取上清液于干燥铝盒中并用电热恒温鼓风干燥箱烘干至恒重，干燥后的残留物重量记为m2。按照公式计算水溶性指数［33］：

脱臭前后牛骨胶原蛋白肽粉白度（W）测定：用电子眼测定脱臭前后的肽粉明度指数和色度指数，并按以下公式计算其白度［34］：

式中，L、a、b是样品在Lab系统中的明度指数和色度指数，白度值越大，说明其颜色越白。

2 结果与分析

2.1 异嗅味肽粉挥发性成分分析

2.1.1 GC-MS 定性分析及定量分析 采用DB-WAX强极性色谱柱对异嗅味牛骨胶原蛋白肽粉中的挥发性成分进行分离，通过质谱和似然比指数（likelihood ration index，LRI）值进行双重判定，结果如表3所示，总离子流图如图1 所示。共检测到32 种挥发性组分，包括3种烷烃类、6种醇类、1种酚类、6种醛酮类、12种酸类、3 种酯类。由表3 可知，异嗅味牛骨胶原蛋白肽粉挥发性物质中酸类化合物居多。研究表明，酸类化合物的气味使人不悦［35］，其中浓度最高的为异丁酸（6 488.184 μg·kg-1），其次是己酸、乙酸、丁酸、异戊酸、戊酸等，浓度分别为2 569.26、1 497.86、1 487.75、929.10、500.76 μg·kg-1。

图1 异嗅味肽粉挥发性成分的HS-SPME-GC-MS总离子流图Fig.1 HS-SPME-GC-MS total ion flow diagram of volatile components of isoolfactory peptide powder

表3 异嗅味肽粉的挥发性成分及相对含量Table 3 Volatile components and relative content of heteroolfactory peptide powder

2.1.2 香气成分ROAV 值及评价 表4 列出了采用ROAV 法鉴定出的异嗅味肽粉中的6 种气味活性物质（ROAV＞1），这6 种气味活性化合物都属于脂肪酸（异丁酸、己酸、乙酸、丁酸、异戊酸、戊酸），其气味分别描述为窖泥臭、汗臭、酸臭、哈喇味、汗臭、酸臭［36］。ROAV 值最高的为丁酸，为1.54，该物质在臭豆腐、白酒［37-38］中的气味贡献较大，其次为乙酸、戊酸、异丁酸、己酸，相对香气活性值分别为1.43、1.29、1.09、1.02，这些气味描述与异嗅味肽粉所体现出的气味一致，因此，异丁酸、己酸、乙酸、丁酸、异戊酸、戊酸可能是牛骨胶原蛋白肽粉异嗅味的主要呈味物质。

表4 ROAV 法鉴定异嗅味肽粉的特征气味成分Table 4 characteristic odor components of heteroolfactory peptide powder identified by ROAV method

2.2 酯化反应脱臭单因素试验结果分析

2.2.1 乙醇添加量对脱臭效果的影响 由图2 可知，乙醇添加量对肽保留率影响较小（P＞0.05），而对感官品质影响较大（P＜0.05）。当乙醇添加量为1%时，虽然肽保留率最高（87.22%），但感官评价得分较低（55.03）；当乙醇添加量为3%时，虽然肽保留率较低（82.78%），但感官评价得分最高（70.81），原因可能是3%的乙醇添加量使异嗅味物质与乙醇所发生的乙酯化反应达到动力学平衡［39］。综上所述，选择最佳乙醇添加量为3%。

图2 乙醇添加量对肽粉脱臭的影响Fig.2 Effect of ethanol addition on deodorization of peptide powder

2.2.2 反应温度对脱臭效果的影响 由图3 可知，反应温度对肽保留率影响较大（P＜0.05），而对感官品质影响较小（P＞0.05）。当反应温度为100 ℃时，虽然肽保留率最高（86.70%），但感官评价得分最低（56.70）；当反应温度为80 ℃时，虽然肽保留率较低（82.70%），但感官评价得分最高（71.14），综合肽保留率和感官评价得分指标，选择最佳反应温度为80 ℃。

图3 反应温度对肽粉脱臭的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on deodorization of peptide powder

2.2.3 反应时间对脱臭效果的影响 由图4 可知，反应时间对肽保留率影响较小（P＞0.05），而对感官品质影响较大（P＜0.05）。当反应时间为10 min 时，虽然肽保留率最高（82.80%），但感官评价得分最低（54）；当反应时间为30 min 时，虽然肽保留率较低（72.80%），但感官评价得分最高（71.23），综合肽保留率和感官评价得分指标，选择最佳反应时间为30 min。

图4 反应时间对肽粉脱臭的影响Fig.4 Effect of reaction time on deodorization of peptide powder

2.3 Box-Behnken试验结果与分析

2.3.1 模型的建立及显著性检验 在单因素试验的基础上，以感官评分（Y）为响应值，以乙醇添加量（X1）、反应温度（X2）和反应时间（X3）为考察因素进行Box-Behnken试验，试验因素与水平见表5，试验结果与分析见表6。

表5 肽粉脱臭条件优化Box-Behnken试验因素与水平Table 5 Optimization of deodorization conditions of peptide powder box Behnken test factors and levels

运用Design Expert 10 软件对表6 中的感官评价得分进行拟合，得到如下回归方程：Y＝72.71＋1.49X1＋1.90X2＋1.39X3－1.64X1X2－0.56X1X3＋2.61X2X3－3.03X12－4.14X22－4.22X32。

表6 肽粉脱臭条件优化Box-Behnken试验结果与分析Table 6 Optimization of deodorization conditions of peptide powder box Behnken test results and analysis

对上述回归方程进行方差分析，结果见表7。所建立模型P＜0.05，该模型具有较高的可靠性。调整决定系数R2Adj=0.824，表明牛骨胶原蛋白肽粉感官评分的82.45%来自乙醇添加量、反应温度和反应时间的影响。方差分析影响牛骨胶原蛋白肽粉除臭的3 个因素的主次顺序为X2＞X1＞X3，即反应温度＞乙醇添加＞反应时间，其中主要因素X2、交互项X2X3以及X12对结果有显著影响（P＜0.05），X22、X32对结果有极显著影响（P＜0.01）。X1、X3、X1X2和X1X3对结果无显著影响（P＞0.05）。

表7 响应面试验结果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface experiments results

2.3.2 酯化反应的除臭响应面测试结果分析 除臭响应面测试结果如图5 所示。当反应时间固定时，随着反应温度和乙醇添加量的增加，牛骨胶原蛋白肽粉脱臭后的感官评价得分先升高后降低。等高线为闭合椭圆形，响应面为凸形，表明反应温度和乙醇添加量之间的相互作用较大，且具有最大值。

图5 各因素交互作用对脱臭后肽粉感官评分影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface and contour of the interaction of various factors on the sensory score of deodorized peptide powder

在反应温度一定的情况下，随着反应时间和乙醇添加量的增加，牛骨胶原蛋白肽粉脱臭后的感官评价得分先升高后降低。轮廓线呈闭合椭圆形，响应面呈凸形，表明反应时间与乙醇添加量之间的相互作用较强，且存在最大值。

当乙醇添加量一定时，随着反应时间和反应温度的增加，牛骨胶原蛋白肽粉脱臭后的感官评价得分先升高后降低，且响应面呈凸形，表明反应时间和反应温度之间的相互作用存在最大值。

由响应面测试分析计算的最佳工艺参数为反应时间28.43 min、乙醇添加量3.19%、反应温度75.41 ℃。此时，牛骨胶原蛋白肽粉除臭后的感官评价预测得分为71.16 分。为了便于实际操作，将最佳工艺参数修改为反应时间28 min、乙醇添加量3%、反应温度75 ℃。在此条件下，牛骨胶原蛋白肽粉脱臭后的感官评价得分为72.15分，与模型预测值（71.16分）较为一致，验证了模型的可靠性。

2.3.3 脱臭前后牛骨胶原蛋白肽粉品质变化 由表8 可知，异嗅味牛骨胶原蛋白肽粉在优化后的总氮含量较优化前有轻微下降，说明此脱臭方法对肽粉的总氮含量影响较小；优化后灰分含量增大，推测是因为酯化反应下加入的氢氧化钙中的钙离子与牛骨胶原蛋白肽粉发生螯合，形成的肽钙螯合物有助于促成骨细胞分化［40-41］；水分含量下降是由于脱臭工艺中的喷雾干燥高温使其中水分挥发更多［42］。优化样的溶解度为71.40%，较原样溶解度（85.70%）有所下降，可能是由于脱臭工艺中喷雾干燥使脱臭前后粉体的比表面积不同，导致肽粉的分散性和溶解性不同［33］。优化样的白度为87.35，较原样白度（71.60）有所增大，表明脱臭后肽粉颜色也发生了变化，使肽粉颜色更白，感官更优。

表8 脱臭前后肽粉理化指标Table 8 Physical and chemical indexes of peptide powder before and after deodorization

2.3.4 脱臭前后牛骨胶原蛋白肽粉特征气味物质变化 脱臭前后肽粉中所检测出的异嗅味特征气味物质及含量如表9 所示。脱臭后经GC-MS 测定优化样中未检测出肽粉原样中呈异嗅味的特征气味物质，表明脱臭效果明显。

表9 脱臭前后肽粉特征气味物质浓度变化Table 9 Changes of characteristic odorant concentration of peptide powder before and after deodorization

3 讨论

在胶原蛋白肽类食品脱臭研究领域，丛瑶等［5］用4 种不同树脂对鱼皮胶原蛋白肽进行脱腥处理，最终确定D4006 树脂与酶解液添加量为5 g∶100 mL 时，在3 h、25 ℃条件下的脱腥效果最为明显。陈增鑫等［10］在对海参肠卵酶解液脱腥的研究中，用生姜掩盖法、活性炭吸附法、大孔树脂吸附法、酵母发酵法和乳酸菌发酵法进行脱腥处理，最终得出在乳酸菌添加量0.40%、反应温度40 ℃、反应时间10 h 条件下的脱腥效果显著。张健等［7］对柞蚕蛹免疫蛋白进行脱臭，发现在固液比1∶10、温度70 ℃、双氧水用量2%、时间20 min 条件下基本达到蛹蛋白脱臭效果。综上，前人研究均采用物理法、生物法、化学法等进行脱臭工艺处理，未在脱腥、脱臭前对异嗅味物质进行探究，本研究在对异嗅味牛骨胶原蛋白肽脱臭前通过GC-MS 结合ROAV 法对异嗅味物质进行了鉴定，为后续有目的性地将这些呈臭味的脂肪酸去除奠定了基础。

施祺儒等［43］以氢氧化钠作为催化剂催化聚甘油与脂肪酸反应直接酯化来制备聚甘油脂肪酸酯，黄慧［44］选择碳酸钠为催化剂对山梨醇和聚油酸进行的催化反应研究，两者研究结果均表明碱类物质也可作为酯化反应的催化剂进行反应，本研究在此基础上利用氢氧化钙催化异嗅味物质与乙醇发生酯化反应。此法中氢氧化钙既可作为酯化反应的催化剂，又可用以调节肽粉溶液pH值，实现了材料的充分利用。借助单因素试验、响应面优化法对异嗅味牛骨胶原蛋白肽粉进行脱腥除臭工艺研究，效果与单独使用正交试验相比，在有多因子参与的情况下试验结果更具科学性和说服力［12］。脱臭前后除在白度方面有明显改善外，各理化指标变化不明显，说明此方法对牛骨胶原蛋白肽品质影响较小，且反应简捷、高效，对工业化生产有积极作用。

4 结论

本研究通过对含异嗅味挥发性物质的牛骨胶原蛋白肽粉进行分析发现，臭味物质主要由异丁酸、己酸、乙酸、丁酸、戊酸、异戊酸组成。单因素和响应面试验显示，在反应时间28.43 min、乙醇添加量3.19%、反应温度75.41 ℃条件下的感官评价得分最高，为71.16，除臭效果明显。综上，超声辅助一锅法对去除牛骨胶原蛋白肽粉异嗅味物质，提高牛骨胶原蛋白肽粉质量具有积极的意义。该法完善和发展了牛骨胶原蛋白肽粉的除臭工艺，对提高牛骨附加值具有重要作用。