活血通络方调控Rho/ROCK通路对脑卒中大鼠肢体运动功能恢复的影响

张 波，义 艳，王 永，蒋 科

脑卒中恢复期多遗留肢体运动功能障碍[1]。积极改善肢体运动功能障碍是脑卒中恢复治疗的重要任务，也是当代神经医学亟待解决的关键问题[2]。脑卒中属中医“中风病”范畴，且中医药在脑卒中康复治疗方面，有其悠久历史[3]。活血通络方以补阳还五汤为基础，并加用息风止痉、温经通络药物组合而成，临床报道发现，其有利于脑卒中后遗症病人肢体、语言、神经等功能恢复[4]。但其促进功能恢复的具体机制还不甚明确。目前，研究发现，脑卒中后遗肢体运动功能恢复，与运动冲动传导、调节有关的传导束-皮质脊髓束神经再生、修复及重塑关系密切[5]。肉瘤同源基因A(RhoA)/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)通路是神经生长抑制及神经轴突生长溃变的关键通路，且已逐渐成为治疗中枢神经损伤的新靶点[6]。活血通络方能否通过调控RhoA/ROCK通路，调节皮质脊髓束重塑，影响前肢功能恢复的相关报道较少。本研究建立大鼠脑卒中模型，对此进行验证，以期阐明活血通络方改善脑卒中后遗症病人肢体功能恢复的可能机制，并为其开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 清洁健康Wistar雄性大鼠120只，7～8周龄，体质量280～300 g，购自福州海王福药制药有限公司，生产及使用许可证号分别为SCXK(闽)2020-0001及SYXK(闽)2020-0006。本院动物房中常规适应性饲养1周。本实验经本院动物伦理委员会批准同意，符合3R原则。

1.1.2 主要试剂及仪器 活血通络方(延胡索20 g，丹参20 g，木瓜16 g，地风20 g，千年健20 g，鸡血藤20 g，党参15 g，川芎10 g，当归10 g，白芷15 g，红花15 g，桃仁10 g，桑叶15 g，土鳖虫10 g等)中诸药均购自张仲景大药房，将方中诸药加蒸馏水常规煎煮后过滤，取滤液浓缩至含生药浓度为0.868 g/mL的浓缩液备用。生物素化葡聚糖胺(BDA)试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司，货号：OR97402)；生长相关蛋白(GAP-43)、RhoA、ROCK2、髓鞘相关阻断因子(Nogo-A)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)等抗体均购自美国abcam公司，货号：ab75810、ab187027、ab125025、ab62024、ab277524；Axio Imager 2光学显微镜(北京普瑞赛司仪器有限公司)；JS-1070P/Mini化学发光成像仪(上海向帆仪器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脑卒中模型建立及分组给药 参照文献[7]用右侧大脑中动脉阻塞术制备脑卒中模型，术后1周，若大鼠出现向左侧转圈或倾倒、左前肢屈曲及行走困难现象，视为造模成功。共造模成功100只，将造模成功的大鼠随机分为模型组、活血通络方低剂量组(8.68 g/kg)、活血通络方高剂量组(34.72 g/kg)、LPA组(RhoA激动剂，5 nmol/kg)、活血通络方+LPA(活血通络方34.72 g/kg+LPA 5 nmol/kg)，每组20只。另取20只大鼠，只暴露右侧中动脉，不进行结扎，其余方法同模型组，作为假手术组。各组大鼠均于造模成功后开始给药，活血通络方按人与动物等效剂量的1倍、4倍设置低、高剂量组，并制备成含生药浓度为0.868 g/mL、3.472 g/mL的混悬液，按10 mL/kg的体积灌胃给药；LPA参照文献[8]设置剂量，用生理盐水稀释成浓度为50 μmol/L的混悬液，按0.1 mL/kg的体积，用脑立体定向仪于前囟中点后左侧3.5 mm、4.5 mm处注入LPA溶液各约25 μL；活血通络方+LPA组灌胃给予活血通络方溶液的同时，用脑立体定向仪定向注入LPA溶液；模型组及假手术组灌胃给予等量生理盐水并用脑立体定向仪于相同部位注入等量生理盐水；活血通络方给药每日2次，LPA给药每周1次，各组连续给药4周。

1.2.2 足失误试验及走横木试验评价大鼠给药前后肢体运动功能协调状况 于大鼠给药前(术后1周后)及给药结束后(术后5周后)，分别对大鼠进行足失误试验及走横木试验。足失误试验参照文献[9]用直径1.5 mm的铁丝制作网格边长为2.5 cm，面积为45 cm×30 cm，高2.5 cm的网格平台，记录大鼠在网格平台上掉落网格中的次数(失足次数)，足失误比率=失足次数/前肢行走总步数×100%，足失误比率越高，其前肢运动协调能力越差。横木行走试验参照文献[10]将大鼠放置于长120 cm、宽2 cm、厚1 cm、高于地面80 cm的水平悬空横木上，观察大鼠在横木上行走状况，并进行评分，总分为6分，其评分越低，预示后肢运动功能越差。

1.2.3 生物素化葡聚糖胺(BDA)法检测大鼠颈髓组织中皮质脊髓束阳性纤维表达变化 各组大鼠于术后4周(给药结束前1周后)，随机取10只，参照文献[11]用脑立体定向仪于大鼠前囟中点后1 mm、2 mm及左侧旁开3.5 mm、4.5 mm处共4个部位注射10% BDA溶液0.2 μL，1周后麻醉处死，取左右两侧C4～C6节段约4 cm颈髓组织，4%多聚甲醛固定24 h，不同浓度梯度蔗糖溶液脱水，冰冻包埋剂(OCT)包埋后，切成厚度为40μm的连续冠状冰冻切片。取冰冻切片，用0.5%过氧化氢溶液抗原灭活15 min，0.3%曲拉通4 ℃透化6 h后，加入浓度为0.8 μg/L的辣根过氧化物酶(HRP)常温孵育过夜，并用二氨基联苯胺(DAB)显色、中性树脂封片后，置于显微镜下观察BDA阳性表达的平均光密度值。

1.2.4 免疫荧光法检测大鼠颈髓组织中皮质脊髓束GAP-43阳性表达水平 各组剩余10只大鼠给药结束后，麻醉处死，取左右两侧C4～C6节段约4 cm颈髓组织，左侧颈髓组织剪取0.5 cm后置于-80 ℃冰箱保存备用。剩余两侧颈髓组织置于4%多聚甲醛24 h，然后蔗糖梯度脱水，恒冷箱切片，约20 μm厚，磷酸盐缓冲液冲洗及0.25%曲拉通透化，加入一抗(GAP-43，1∶800)4 ℃孵育过夜，加入荧光二抗(羊抗兔FTTc，1∶500)室温孵育2 h，磷酸盐缓冲液再次冲洗，置于载玻片上并加荧光封片剂封片，每片随机取5个视野，在激光共聚焦显微镜下采集图像，用Image Pro Plus 5.0系统分析图像阳性表达的平均光密度值。

1.2.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测左侧颈髓组织RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表达 取1.2.4中-80 ℃保存的左侧颈髓组织，4 ℃解冻、组织匀浆器匀浆、裂解液裂解、离心提取蛋白，双辛可宁酸(BCA)法测蛋白总浓度。取100 μg蛋白上样、电泳、转膜反应，加入一抗RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG(1∶800)，内参β-actin(1∶3 000)4 ℃孵育过夜，加入HRP羊抗兔二抗(1∶3 000)室温孵育3 h，增强化学发光法显色，以化学发光成像仪观察条带并拍照，以Image-J软件分析各组蛋白相对表达。

2 结 果

2.1 活血通络方对大鼠肢体运动能的影响 脑卒中术后1周(治疗前)，与假手组相比，模型组及各给药组足失误比率升高(P<0.05)，走横木评分较术后1周降低(P<0.05)，提示大鼠出现肢体运动功能障碍。术后5周(给药后)，模型组足失误比率较术后1周降低(P<0.05)，走横木评分较术后1周升高(P<0.05)，预示脑卒中大鼠肢体运动功能存在自发恢复现象。活血通络方低剂量组、高剂量组大鼠给药结束后，足失误比率较术后1周降低(P<0.05)，走横木评分较术后1周升高(P<0.05)，且上述指标改善效果越好，肢体运动功能恢复越好。术后5周，LPA组大鼠足失误比率及走横木评分较术后1周无明显变化(P>0.05)，其肢体运动功能障碍比模型组严重(P<0.05)。术后5周，活化通络方+LPA可逆转活血通络方高剂量组上述作用(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠足失误比率及走横木评分比较(±s)

2.2 活血通络方对大鼠颈髓组织BDA阳性表达的影响 与假手术组相比，模型组大鼠左侧及右侧颈髓组织BDA阳性表达均降低(P<0.05)；与模型组相比，活血通络方低剂量组、高剂量组大鼠左侧颈髓组织BDA阳性表达降低(P<0.05)，右侧颈髓组织BDA阳性表达升高(P<0.05)，且剂量越高变化越明显(P<0.05)；LPA组左侧颈髓组织BDA阳性表达较模型组、活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组升高(P<0.05)，右侧颈髓组织BDA阳性表达较模型组、活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组降低(P<0.05)。活血通络方+LPA可逆转活血通络方高剂量组上述作用(P<0.05)。详见图1、表2。

图1 各组大鼠给药结束后BDA阳性表达染色图(×400)

表2 各组大鼠颈髓组织BDA阳性表达比较(±s)

2.3 活血通络方对大鼠颈髓组织GAP-43阳性表达的影响 与假手术组相比，模型组大鼠左侧及右侧颈髓组织GAP-43阳性表达均降低(P<0.05)；与模型组相比，活血通络方低剂量组、高剂量组大鼠左侧颈髓组织GAP-43阳性表达较模型组、活化通络方低剂量组、活血通络方高剂量组降低(P<0.05)，右侧颈髓组织GAP-43阳性表达升高(P<0.05)，且剂量越高变化越明显(P<0.05)；LPA组左侧颈髓组织GAP-43阳性表达较模型组、活化通络方低剂量组、活血通络方高剂量组升高(P<0.05)，右侧颈髓组织GAP-43阳性表达较模型组、活化通络方低剂量组、活血通络方高剂量组降低(P<0.05)。活血通络方+LPA可逆转活血通络方高剂量组上述作用(P<0.05)。详见图2、表3。

图2 各组大鼠给药结束后GAP-43免疫荧光图(×400)

表3 各组大鼠颈髓组织GAP-43阳性表达比较(±s)

2.4 活血通络方对大鼠左侧颈髓组织RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表达的影响 与假手术相比，模型组大鼠左侧颈髓组织RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组相比，活血通络方低剂量组、高剂量组大鼠左侧颈髓组织RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表达进一步降低(P<0.05)，且活血通络方剂量越高蛋白表达降低越明显(P<0.05)。LPA组大鼠左侧颈髓组织RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表达较模型组、活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组升高(P<0.05)。活血通络方+LPA可逆转活血通络方高剂量组上述作用(P<0.05)。详见图3、表4。

图3 各组大鼠左侧颈髓组织RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白免疫印迹图

表4 各组大鼠左侧颈髓组织RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表达水平比较(±s)

3 讨 论

脑卒中病人多发生肢体、语言、认知等功能障碍，其中，肢体运动功能障碍是脑卒中恢复期最常见的并发症，其给家庭及社会带来沉重负担的同时，也给病人带来巨大打击[12]。本研究用脑中动脉阻塞法制备大鼠脑卒中模型后发现，大鼠前肢足失误比率均升高，预示大鼠出现肢体运动功能障碍，提示造模成功。中医认为“脑主运动”“脑为髓海”，髓海不足是引起脑卒中恢复期症状缠绵难愈的重要原因，用活血、补气、通络法来生精益髓、滋养脑络，可改善脑卒中后半身不遂、肢体麻木、瘫痪症状[13]。活血通络方中延胡索、地风、千年健可活血通经络，党参、当归等可补益气血，丹参、鸡血藤可促进麻痹神经恢复，对麻木瘫痪病人有较好的疗效[4，14]。李峰等[15]发现活血通络方对脑卒中后肢体运动功能障碍有较好的改善作用。本研究发现，大鼠前肢足失误比率随活血通络方剂量的升高而降低，进一步证实活血通络方可能为改善脑卒中后肢体运动功能障碍的潜在药物，但其具体机制还需进一步探究。

皮质脊髓束是重要的运动神经元，与高度技巧性的随意运动调节及传导有关，是沟通脑和脊髓、支配随意运动的关键神经传导束[16]。中枢神经轴突所处的抑制环境(如Nogo-A、MAG等神经抑制因子的分泌)及中枢神经细胞的低再生能力等因素，使得皮质脊髓束损伤后再生困难，也使得脑卒中后遗功能障碍恢复困难[17]。而未损伤侧皮质脊髓束重塑，可以代偿性地促进运动功能恢复，即皮质脊髓束损伤后异常路径恢复，越来越受到临床研究者的关注[18]。刘维等[11，19]研究发现，脑卒中发生后未损伤侧大脑皮质脊髓束可进行侧支发芽，并跨越中线至对侧未损伤区进行双侧支配，而促进肢体运动功能恢复作用，提示皮质脊髓束异常路径重塑，可能在脑卒中运动功能恢复过程中发挥重要作用。BDA及GAP-43为神经纤维及轴突生长失踪器，其表达的升高，预示神经纤维及轴突的再生长。刘维等[11]发现脑卒中后2周，大鼠脑梗死对侧颈髓BDA及GAP-43表达无变化，而梗死侧BDA及GAP-43表达升高，并推测脑梗死侧颈髓中的阳性纤维，可能是由脑梗死对侧脊髓束纤维芽生长及跨越延伸而生成。本研究发现，模型组大鼠脑卒中术后5周末，损伤侧与未损伤侧皮质脊髓束纤维BDA及GAP-43阳性表达均降低，大鼠肢体运动功能较1周前有所恢复，提示模型大鼠未损伤侧皮质脊髓束可能自发重塑，并跨越至对侧损伤侧支配运动功能调节，从而促进肢体运动功能恢复，这与Jang等[18-19]研究提出的皮质脊髓束异常路径重塑促进肢体运动功能恢复的机制相一致。活血通络方剂量越高，大鼠未损伤侧BDA及GAP-43阳性表达越低，损伤侧BDA及GAP-43阳性表达越高，大鼠肢体运动功能恢复越明显，提示活血通络方发挥促进肢体恢复作用可能与促进皮质脊髓束异常路径重塑有关。

RhoA可表达于神经元内，ROCK2是髓鞘抑制性信号的主要效应分子，RhoA可与神经再生抑制因子-Nogo-A受体结合，特异性刺激下游ROCK2通路，并调控神经抑制因子Nogo-A、MAG表达，发挥神经生长抑制和生长锥溃变作用，阻断RhoA-ROCK2信号通路，可解除神经生长负性调控因子(如Nogo-A、MAG)表达，发挥促神经纤维及轴突生长及重构作用[20]。本研究发现，模型组大鼠未损伤侧颈髓组织中RhoA及ROCK2蛋白表达及其调控的神经再生抑制因子相关蛋白Nogo-A、MAG表达均明显低于假手术组，用RhoA激活剂激活大鼠未损伤侧颈髓组织中RhoA-ROCK2信号通路及Nogo-A、MAG表达后，未损伤侧BDA及GAP-43阳性表达与假手术组相近的同时，损伤侧未见BDA及GAP-43阳性表达的纤维新生，大鼠肢体运动功能恢复最弱，提示未损伤侧颈髓组织中RhoA/ROCK表达抑制，可能参与脑卒中后未损伤侧皮质脊髓束自发异常路径重塑促肢体运动功能修复过程。活血通络方剂量越高，RhoA-ROCK2信号通路及其Nogo-A、MAG蛋白表达越低，提示活血通络方促进脑卒中皮质脊髓束异常路径重塑促肢体运动功能修复作用，可能与抑制未损伤侧皮质脊髓束RhoA-ROCK2通路活化有关。而RhoA激活剂可逆转活血通络方上述作用。

综上所述，活血通络方可能通过抑制脑卒中未损伤侧皮质脊髓束RhoA-ROCK2通路活化，促进皮质脊髓束异常路径重塑，发挥促进肢体运动功能恢复的作用。但皮质脊髓束重塑及促肢体运动能恢复的调控网络复杂，涉及多种途径、多条调控机制，活血通络方促进脑卒中肢体运动功能恢复的其他机制，还有待继续深入探究。