赤芍总苷对脑出血大鼠神经功能损伤的改善及对脑组织中Treg/Th17比例的影响

贾传宇，王舒阳，管海博

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一种非创伤性血管破裂，导致血液在脑实质内聚集的高发病率、高死亡率和高致残率的常见难治性脑血管疾病之一[1]。脑出血后能激活小胶质细胞分泌大量毒性物质，进而引起脑水肿、神经元损伤和神经功能损伤[2]。研究表明，炎症在脑出血诱发的继发性损伤中起着重要作用，并且活化的小胶质细胞释放的炎性因子加剧了中枢神经系统的神经损伤[3]。辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)是两类重要的CD4+T细胞免疫细胞亚群[4]。Th17细胞能够促进炎症反应，主要分泌白细胞介素(IL)-17等炎性因子，而Treg细胞能够抑制炎症反应，主要分泌IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)等炎性因子，机体稳定时，Treg/Th17相对平衡，平衡被打破则会引起多种疾病[5]。近年来，临床治疗脑出血困难，但一些中药对治疗脑出血表现出良好的效果，赤芍就是治疗脑出血的药物之一。赤芍具有抗凝、抗栓和改善血液循环的功效，其有效成分为芍药苷、芍药新苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷等单萜苷类化合物，统称赤芍总苷(total paeony glycoside，TPG)[6]。本研究通过探索赤芍总苷对脑出血大鼠神经功能损伤的改善及对脑组织中Treg/Th17比例的影响，为赤芍总苷治疗脑出血提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只无特定病原体(SPF)级成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体质量260～300 g，由北京维通利华实验动物公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠均饲养于温度、湿度适宜的清洁无菌环境，自由饮水和摄取食物。所有实验均获得医院伦理委员会同意。

1.2 仪器与试剂 脑立体定位仪购于美国Stoelting公司；水合氯醛、乙醇、甲醛均购自北京益利精细化学品有限公司；IL-17、IL-10和TGF-β 酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒均购自赛默飞世尔科技公司；大鼠抗CD3 APC、CD4 FITC、CD8 PerCP、CD25 APC、FoxP3 PE、IL17A PE均购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与造模 选取50只SPF级成年SD雄性大鼠，随机分为5组：空白组、脑出血组、赤芍总苷高剂量组、赤芍总苷中剂量组和赤芍总苷低剂量组，每组10只。脑出血大鼠造模参照自体血局部注入法进行[7]。空白组：正常饲养大鼠；脑出血组：使用10%的水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯卧固定于脑立体定位仪上，剪毛消毒后，在头皮正中线上纵向切开10 mm露出前囟，然后在前囟的前0.2 mm、右3.0 mm处使用三棱针钻开颅骨，进针深度为5.5 mm，直径为0.5 mm。在尾尖0.5 cm处斩断鼠尾，取100 μL血，以10 μL/min的速度缓慢注入，留针15～20 min后缓慢退出，用骨蜡封闭颅骨，缝合皮肤并消毒。赤芍总苷高剂量组：同脑出血组方法制造脑出血模型，于造模1 h后腹腔注射200 mg/kg赤芍总苷，每日1次，连续7 d；赤芍总苷中剂量组：同脑出血组方法制造脑出血模型，于造模1 h后腹腔注射100 mg/kg赤芍总苷，每日1次，连续7 d；赤芍总苷低剂量组：同脑出血组方法制造脑出血模型，于造模1 h后腹腔注射50 mg/kg赤芍总苷，每日1次，连续7 d。

1.3.2 神经功能损伤评估 参照Bederson评分[8]方法，于造模后6 h、1 d、2 d、3 d、7 d进行神经功能损伤评分。评分标准如下，0级：无神经功能损伤，计0分；1级：大鼠前肢出现弯曲，计1分；2级：前肢抵抗对侧推力减弱，计2分；3级：前肢抵抗对侧推力减弱，有旋转现象，计3分。

1.3.3 脑组织苏木精-伊红(HE)染色 将大鼠麻醉后取出大脑，放入福尔马林溶液中固定，经过脱水和包埋后，制作石蜡切片(厚度为5 μm)，然后进行HE染色，再使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后使用中性树胶封片，并在光学显微镜下观察脑组织。

1.3.4 ELISA法检测脑组织中IL-17、IL-10和TGF-β的含量 将大鼠麻醉后取出大脑，立即置于液氮研磨，提取蛋白，使用ELISA法按照试剂盒说明书检测脑组织中IL-17、IL-10和TGF-β的含量。

1.3.5 流式细胞术检测脑组织中Treg/Th17的变化 将大鼠麻醉后取出大脑，使用生理盐水冲洗脑组织，剪碎放入磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，加入1 mL 0.25%的胰酶，在37 ℃放置10 min；加入血清终止后，使用30目尼龙网过滤并离心，使用PBS稀释成单细胞悬液，并调整细胞浓度至5×109/L。取单细胞悬液，离心后用4%的多聚甲醛固定30 min，然后使用0.1%的Triton X-100处理15 min，再使用10%牛血清白蛋白(BSA)-PBS重悬。使用CD3+、CD8-、IL-17A+标记Th17细胞，CD4+、CD25+、FoxP3+标记Treg细胞，然后采用流式细胞仪检测Th细胞亚群比例。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能损伤评分 与空白组相比，脑出血组各个时间段大鼠神经功能损伤评分明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在造模后6 h、1 d和2 d，赤芍总苷高剂量组和赤芍总苷中剂量组大鼠神经功能损伤评分与脑出血组相比差异均无统计学意义(P>0.05)；在造模后3 d和7 d，与脑出血组相比，赤芍总苷高剂量组和赤芍总苷中剂量组大鼠神经功能损伤评分明显降低，且差异均有统计学意义(P<0.05)；赤芍总苷低剂量组各时间段大鼠神经功能损伤评分与脑出血组相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠神经功能损伤评分(±s) 单位：分

2.2 各组大鼠脑组织一般病理形态学光学显微镜下观察结果 空白组大鼠脑组织细胞排列整齐有序，染色均匀，未见间质水肿和炎性细胞浸润；脑出血组大鼠脑组织疏松，排列不整齐，细胞呈气球样变，坏死，且神经细胞变性、坏死，有明显间质水肿和炎性细胞浸润现象；赤芍总苷高剂量组和赤芍总苷中剂量组大脑组织病变明显改善，神经细胞变性、坏死数量减少，炎性细胞浸润明显减轻；赤芍总苷低剂量组脑组织疏松有所改善，但排列仍不整齐，神经细胞变性、坏死数量未见明显减少，炎性细胞浸润也未明显减少。

2.3 ELISA法检测脑组织中IL-17、IL-10和TGF-β的含量 与空白组相比，脑出血组脑组织中IL-17含量明显升高，IL-10和TGF-β含量明显降低，且差异均有统计学意义(P<0.05)；与脑出血组比较，赤芍总苷高剂量组和赤芍总苷中剂量组脑组织中IL-17含量明显降低，IL-10和TGF-β含量明显升高，且差异均有统计学意义(P<0.05)；赤芍总苷低剂量组大鼠脑组织中IL-17、IL-10和TGF-β含量与脑出血组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脑组织中IL-17、IL-10和TGF-β含量比较(±s) 单位：ng/mL

2.4 流式细胞术分析脑组织Th17和Treg的比例 与空白组相比，脑出血组单个脑组织细胞液中Th17比例和Th17/Treg比值明显升高，Treg比例明显降低，且差异均有统计学意义(P<0.05)；与脑出血组相比，赤芍总苷高剂量组和赤芍总苷中剂量组单个脑组织细胞液中，Th17比例和Th17/Treg比值明显降低，Treg比例明显升高，且差异均有统计学意义(P<0.05)；赤芍总苷低剂量组在单个脑组织细胞液中Th17比例、Treg比例及Th17/Treg比值与脑出血组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠单个脑组织细胞液中Th17比例、Treg比例及Th17/Treg比值比较(±s)

3 讨 论

脑出血是脑血管疾病脑卒中的第二大类型，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，脑出血后易出现炎性反应，其中，炎性介质可通过损伤脑组织破坏脑屏障或加重脑水肿导致脑损伤[9]。Th17细胞和Treg细胞能够分泌多种炎性因子，且Th17/Treg平衡在炎症反应中也起着重要的作用[10]。赤芍总苷具有调节免疫力、消炎和镇痛等作用[11]。本研究探索赤芍总苷对脑出血大鼠神经功能损伤的改善及对脑组织中Treg/Th17比例的影响，从而为治疗脑出血药物的赤芍总苷提供一定的理论依据。

由大鼠脑组织病理切片图和神经功能评分可知，赤芍总苷对脑出血大鼠神经功能损伤具有改善作用，赤芍总苷具有神经保护作用，可抑制脑出血后水肿的发生。其机制尚未明确，具体机制还需要进一步研究，但赤芍总苷的芍药苷能调节G蛋白偶联受体(GPCR)、腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Janus激酶2(JAK2)/信号转导和转录活化因子(STAT3)等信号通路[12]。

有研究表明，缺血性脑卒中病人的外周血中有Th17/Treg功能失衡的表现[13]。本研究中，脑出血大鼠脑组织中Th17细胞和其分泌的炎性因子IL-17增加；而Treg细胞和其分泌的炎性因子IL-10、TGF-β减少，Th17/Treg细胞比值明显升高，为Th17/Treg平衡参与脑出血的生理病理过程提供了新依据。本研究还表明，赤芍总苷可显著降低Th17细胞和其分泌的炎性因子IL-17水平；而Treg细胞和其分泌的炎性因子IL-10、TGF-β水平明显升高，说明赤芍总苷将炎症环境变为抗炎状态，从而改善脑出血症状。有研究表明，结肠炎也与Th17和Treg细胞之间的平衡有关，而赤芍总苷可以通过调节Th17/Treg细胞的分化和细胞因子的分泌而改善结肠炎[14]。

有关赤芍总苷改善脑出血的研究极少，本研究为赤芍总苷改善脑出血症状提供了一定的依据，但本研究有一定不足之处：只研究了赤芍总苷调节Th17/Treg平衡，其具体机制尚未清晰，还需要进一步研究。