黄连素对波动性高糖导致的人冠状动脉内皮细胞炎症反应的影响

庄 微，李言明，王 磊

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)病人在全球范围内的人数逐年增加，T2DM越来越受到专家、学者的重视[1]。糖尿病(diabetes mellitus，DM)病人致死致残的主要病因是糖尿病并发症，尤其是心血管并发症[2]，研究糖尿病心血管并发症的发病机制及有效防治方法具有重要意义。有研究显示，波动性高糖可能比持续性高糖心血管并发症发生率更高，风险更大[3-4]。T2DM的临床表现与中医学“消渴”相似，《名医别录》曰：“黄连主五脏冷热……止消渴[5-7]”。黄连素(berberine，BBR)是中药黄连中提取的一种生物碱，多项研究提示黄连素对糖尿病及其并发症具有良好的保护作用。本研究观察人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)在波动性高糖环境下的炎症反应，探讨黄连素对波动性高糖导致的HCAECs炎症反应的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HCAECs细胞株购自美国ScienCell公司；RPMI1640培养液购自美国Hyclone公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen Life公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)、人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒购自南京建成生物工程公司；Taq DNA高保真聚合酶PCR Mix试剂、限制性内切酶EcoR I购自日本Takara公司。

1.2 细胞培养及分组 HCAECs在含胎牛血清的RPMI 1640培养液中接种，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期的HCAECs分为5组：①正常血糖组(5.5 mmol/L浓度葡萄糖，NG组)；②持续性高糖组(25 mmol/L浓度葡萄糖，PHG组)；③波动性高糖组(5.5 mmol/L浓度和25 mmol/L浓度葡萄糖24 h波动1次，IHG组)；④对照组(OC组，5.5 mmol/L浓度和25 mmol/L浓度甘露醇24 h波动1次，为波动性高渗环境)；⑤波动性高糖+黄连素组(5.5 mmol/L浓度和25 mmol/L浓度葡萄糖+50 μmol/L黄连素24 h波动1次，IHG+BBR组)，培养7 d。

1.3 IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10蛋白测定 ELISA法测定IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10等炎性因子的蛋白水平，具体检测方法见南京建成生物工程公司试剂盒说明书。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10的mRNA表达 依据qRT-PCR法收集相应RNA样品。将RNA样品反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，具体引物如下，IL-10正向引物：TGAGAACCAAGACCCAGAC，IL-10反向引物：TTCACAGGGAAGAAATCG；IL-1β正向引物：CTCGCCAGTGAAATGAT，IL-1β反向引物：AAGCCCTTGCTGTAGTG；TNF-α 正向引物：CCACCACGCTCTTCTGC，TNF-α 反向引物：GCTTGAGGGTTTGCTACAAC；MCP-1正向引物：AGAATCACCAGCAGCAAG，MCP-1反向引物：GGAATCCTGAACCCACTT。内参基因β-actin正向引物：CCCGAGCCGTGTTTCCT，β-actin反向引物：GTCCCAGTTGGTGACGATGC。反应条件为95 ℃、5 min预变性，95 ℃、15 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40个循环。每个样品检测3次，qRT-PCR仪测定荧光信号变化。收集数据进行统计学分析。

2 结 果

2.1 各组HCAECs的IL-10表达比较 HCAECs在不同环境中培养7 d后，用ELISA法测定IL-10蛋白表达水平，qRT-PCR法测定IL-10 mRNA表达水平。与NG组及OC组相比，PHG组IL-10蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.05)，IHG组IL-10蛋白及mRNA表达水平较PHG组降低(P<0.05)；IHG+BBR组IL-10蛋白及mRNA表达水平较IHG组升高(P<0.05)。详见图1、图2。

与NG组、OC组比较，＊ P<0.05；与PHG组比较，# P<0.05；与IHG组比较，△ P<0.05。

与NG组、OC组比较，＊ P<0.05；与PHG组比较，# P<0.05；与IHG组比较，△ P<0.05。

2.2 各组HCAECs的IL-1β表达比较 与NG组和OC组比较，PHG组IL-1β蛋白和mRNA表达水平升高(P<0.05)。与PHG组比较，IHG组IL-1β蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05)。但IHG+BBR组IL-1β蛋白及mRNA表达水平较IHG组降低(P<0.05)。详见图3、图4。

与NG组、OC组比较，＊ P<0.05；与PHG组比较，# P<0.05；与IHG组比较，△ P<0.05。

与NG组、OC组比较，＊ P<0.05；与PHG组比较，# P<0.05；与IHG组比较，△ P<0.05。

2.3 各组HCAECs的TNF-α表达比较 与NG组和OC组比较，PHG组TNF-α蛋白及mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，IHG组TNF-α蛋白及mRNA较PHG组升高(P<0.05)。与IHG组比较，IHG+BBR组TNF-α蛋白及mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。详见图5、图6。

与NG组、OC组比较，＊ P<0.05；与PHG组比较，# P<0.05；与IHG组比较，△ P<0.05。

与NG组、OC组比较，＊ P<0.05；与PHG组比较，# P<0.05；与IHG组比较，△ P<0.05。

2.4 各组HCAECs的MCP-1表达情况比较 PHG组MCP-1蛋白和mRNA表达较NG组和OC组升高(P<0.05)，IHG组MCP-1蛋白和mRNA表达水平较PHG组升高(P<0.05)。IHG+BBR组MCP-1蛋白和mRNA表达较IHG组明显降低(P<0.05)。详见图7、图8。

与NG组、OC组比较，＊ P<0.05；与PHG组比较，# P<0.05；与IHG组比较，△ P<0.05。

与NG组、OC组比较，＊ P<0.05；与PHG组比较，# P<0.05；与IHG组比较，△ P<0.05。

3 讨 论

目前，关于波动性高糖诱导HCAECs炎症反应的报道较少，是否有药物可有效抑制波动性高糖对HCAECs的炎症反应，从而减缓冠状动脉硬化进程的报道更鲜见。本研究观察黄连素对波动性高糖导致的HCAECs炎症反应的保护作用。既往研究大多关注持续性高糖对机体的影响[8]，然而波动性高糖可能比持续性高糖对糖尿病病人的影响更大。本研究发现，波动性高糖比持续性高糖更易引起HCAECs的炎症反应，用黄连素对波动性高糖环境中的HCAECs进行干预，可减弱HCAECs的炎症反应。这些发现具有重要的临床意义，有助于加深对糖尿病血管并发症的认识。

波动性高糖导致心血管并发症的原因很多，可能涉及炎症反应、氧化应激反应、内皮功能紊乱、凝血机制激活等多个因素[9-10]。IL-1β和TNF-α是经典的炎性因子，MCP-1是单核细胞趋化和激活因子，有文献报道MCP-1在诱导细胞的趋化作用时，常伴随着炎症反应[11-12]。本研究选择IL-1β、TNF-α、MCP-1和IL-10作为评价炎症反应的标志物，观察到HCAECs在波动性高糖环境下比持续性高糖环境下IL-1β、TNF-α、MCP-1表达更强烈。IL-10是炎症抑制因子，IL-10实验结果与IL-1β、TNF-α、MCP-1结果相反。与持续性高糖相比，波动性高糖环境下IL-10表达水平更低。上述结果提示波动性高糖可能比持续性高糖更易引起HCAECs的炎症反应。

黄连素是中药黄连中最丰富的生物活性成分，被认为具有多种体内、体外药理活性。本研究发现，黄连素可显著抑制波动性高糖诱导的HCAECs炎性因子的生成，提示黄连素对波动性高糖导致的HCAECs的炎症反应具有较好的保护作用。上述结果为黄连素在糖尿病及其心血管并发症防治中的作用提供了一些理论依据。

综上所述，黄连素可有效降低波动性高糖诱导的HCAECs的炎症反应，是一种有效改善糖尿病内皮细胞功能的药物，可为糖尿病并发症的防治提供重要的理论基础。在未来工作中，仍需更多的动物实验及大规模临床试验来评估黄连素对糖尿病及其并发症的长期疗效和安全性。