不同光质处理对采后桃果皮色泽及花色苷代谢的影响

池 铭，孙丽娟，马立杰，赵 婧，周宏胜,2，凌 军,2，罗淑芬,2，李国锋,2，李鹏霞,2,3,*，张映曈,2,*

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.江苏省农业科学院，农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室，江苏 南京 210014；3.江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014）

桃是一种营养价值很高的水果，因口感甘甜、鲜美多汁而深受人们的喜爱。随着生活水平的提高，人们对食物的需求逐渐由量转变为质，对水果的色泽也就提出了更高的要求。然而在目前的生产中桃果通常采用套袋模式栽培，该举措能有效减少病虫害发生、保持果面光洁，但却严重影响桃果皮的着色，制约桃果良好外观品质的呈现，直接影响其商品价值和经济效益。因此，开发高效安全的桃采后着色调控技术是目前重要的研究方向。

花色苷是水果的呈色物质，也是桃果皮呈鲜艳红色的主要原因[1]。花色苷不但有助于水果良好外观的呈现，还具有多种重要的生理功能，如抗突变、抗炎、改善肝机能以及通过清除人体内自由基来预防心血管疾病[2]。因此，开展桃果花色苷代谢调控方面的研究不仅有助于提升桃果外观品质，还能提高果实营养价值，具有重要的意义。

花色苷的合成通路目前已基本清晰，通路中的查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）、黄酮3-羟化酶（flavonoid 3-hydroxylase，F3H）和类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶（UDP-glucose:flavonoid-3-Oglucosyltransferase，UFGT）被认为是花色苷合成的限速酶[3]。编码上述花色苷合成酶结构基因的表达受相关转录因子的调控，其中最重要的是MYB、bHLH和WD40。这3 种蛋白相互作用形成调控复合体（MYB-bHLHWD40，MBW），通过与结构基因启动子的直接结合转录激活其表达，进而调控花色苷的合成[4]。

此外，花色苷的生物合成还受到多种外部因素的调控，包括温度、光、植物激素、矿物质和营养物质等[5]。其中光作为最重要的环境因子，与花色苷的合成代谢息息相关，研究表明，对草莓进行光照处理，花色苷含量显著提升，至第25天时，花色苷含量达到对照组的3 倍[6]；在对苹果的研究中，光照处理可以促进果皮中花色苷的积累，且随着光照强度的增加花色苷含量进一步提高[7]；对血橙进行光照处理后，花色苷的积累速率显著提高，处理结束时，花色苷的含量高于对照组133%[8]。但在不同物种中，不同光质对花色苷合成的影响不同，选择合适的光质对诱导花色苷积累有事半功倍的效果，研究发现葡萄经过白光照射处理后颜色显著提升，与黑暗组相比，CHS、F3H和DFR等结构基因表达水平显著提高，花色苷含量提高1.25 倍[9]；蓝莓花色苷则对UV-B有响应，照射处理后其含量与对照组相比提高了10%[10]；在对杨梅的研究中，蓝光和UV-C均可激活转录因子MrMYB1的表达，从而提高下游花色苷合成结构基因的表达，促进花色苷的合成[11-12]；红光照射下，草莓中MBW调控复合体的表达量显著上调，激活了下游花色苷合成通路，最终促进了花色苷合成[13]。然而，目前鲜见不同光质对桃果皮色泽及花色苷代谢影响及机制的系统研究。

本实验旨在探明不同光质对采后桃果皮着色进程及花色苷代谢的影响，并通过分析花色苷合成相关酶活力在光照前后的变化以及结构基因和转录因子编码基因响应光照表达的情况，初步解析不同光质对桃果皮花色苷合成的影响机制，为套袋桃果实色泽提升技术的研发提供理论依据，并为桃采后着色机制的理论研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桃品种为‘中桃九号’，果实采摘时为七成熟（硬度（7.50±0.56）kg/cm2、可滴定酸质量分数（0.15±0.01）%、可溶性固形物质量分数（10.31±0.41）%）。采后4 h内运至江苏省农业科学院农业设施与装备研究所，挑选外观、大小一致且无病虫害、无损伤的桃果实作为实验材料。

β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸 上海麦克林生物科技有限公司；聚乙二醇20000 上海源叶生物科技有限公司；苯丙氨酸 北京百灵威科技有限公司；硼酸 西陇科学股份有限公司；盐酸 南京化学试剂有限公司；醋酸钠 广州市金华大化学试剂有限公司；甲醇 上海凌峰化学试剂有限公司；酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 南京晶美生物科技有限公司；FastPure Plant Total RNA Isolation Kit（Polysaccharides &Polyphenolics-rich）RNA提取试剂盒和HiScript III RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）cDNA合成试剂盒南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LED光源 广东欧曼科技股份有限公司；PL202-L电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-S系列数显恒温水浴锅 常州万达升实验仪器有限公司；CR-400全自动测色色差仪 日本Konica Minolta公司；A11 Basic液氮研磨器 艾卡（广州）仪器设备有限公司；UV-1102型紫外-可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；WD-2102A酶联免疫检测仪 北京市六一仪器厂；CFX connect荧光定量聚合酶链式反应仪美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 不同光照处理

用红、绿、蓝、白4 种光照处理桃果，以黑暗条件作为对照，置于（22±1）℃。各处理组光照周期为12 h光照＋12 h黑暗，对照组为24 h全黑暗处理。LED光源保证各处理间光照强度一致，为1 000 lx（18 μmol/（m2·s））。将样品放置在打孔的聚乙烯袋（50 cm×35 cm，0.2 mm）中，每袋12 个桃果。处理后0、2、4、6、8 d随机选取3 包拍照后测定质量、色差。用不锈钢刀片分离桃果皮，快速置于液氮中速冻并存放在－80 ℃冰箱中，用于测定相关指标。测定指标时用液氮研磨器粉碎混匀，以保证取样具有代表性。

1.3.2 色差的测定

参照王瑶等[14]的方法用CR-400色差仪测定桃果皮的L*值、a*值、b*值、色泽指数CIRG。每个处理测定36 个桃果，结果取平均值。

1.3.3 总花色苷含量的测定

桃果皮中总花色苷含量的测定采用pH示差法[15]：取1 g桃果皮样品，加入5 mL体积分数95%的酸化甲醇（0.1 mol/L HCl），于黑暗条件下振荡提取4 h，离心（11 000×g、4 ℃、15 min）提取上清液。提取液分别用0.025 mol/L氯化钾缓冲液（pH 1.0）和0.4 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 4.5）稀释3.5 倍，室温下放置15 min测定溶液在520 nm和700 nm波长处的吸光度，按式（1）、（2）计算花色苷含量。

式中：Mw为氰化-3-葡萄糖苷的摩尔质量（C15H11O6：449.2 g/mol）；DF为稀释因子；ε为摩尔吸光系数（26 900 L/（mol·cm））。

1.3.4 花色苷代谢相关酶活力的测定

苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力的测定；采用田梦瑶等[16]的方法，将0.5 g样品与2 mL pH 8.8的硼酸缓冲液（0.05 mmol/L）混匀，4 ℃提取1 h。11 000×g、4 ℃离心20 min，所得上清液即为粗酶液。取0.2 mL粗酶液与1 mL苯丙氨酸、2.8 mL硼酸缓冲液混匀，在37 ℃水浴1 h后加入0.2 mL 6 mol/L HCl溶液。测定反应液在290 nm波长处的吸光度，计算每克蛋白的PAL活力，单位为U/g。

CHS、CHI、DFR、UFGT、F3H、花色素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）活力采用ELISA试剂盒测定，计算每克蛋白的酶活力，单位为U/g。

1.3.5 花色苷合成相关基因表达量的测定

1.3.5.1 RNA的提取及cDNA的合成

RNA提取按照FastPure Plant Total RNA Isolation Kit（Polysaccharides &Polyphenolics-rich）RNA提取试剂盒进行操作。cDNA的合成使用HiScript III RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）cDNA合成试剂盒进行操作。

1.3.5.2 实时荧光定量聚合酶链式反应分析

按照表1的反应体系进行实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qPCR），采用2－ΔΔCt法计算相对表达量。每个处理3 次重复。引物序列参照表2设计。qPCR程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸5 s，39 个循环。

表1 qPCR体系（20 μL）Table 1 Composition of quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) system (20 μL)

表2 qPCR引物序列Table 2 Primer sequences used for qPCR

1.4 数据处理与分析

所有数据进行3 次平行测定，数据采用平均值±标准误差表示，使用SPSS 22.0软件中单因素方差分析进行显著性分析（P＜0.05为差异显著），采用Pearson相关系数法进行相关性分析，并用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同光照处理对桃果皮着色的影响

色泽是影响消费者购买欲的最直接因素，套袋栽培限制了桃果花色苷的合成，导致果面泛白[17]，影响其商品价值。采后进行不同光照处理对桃果皮着色影响不同。由图1可知，红光、绿光处理组与对照组没有明显差异，白光处理组从第4天开始有微弱的红色，而蓝光处理组从第6天开始即呈现鲜艳红色。说明白、蓝光照射能够促进采后桃果皮色泽的形成，提升桃的外观品质，其中蓝光处理效果更佳。

图1 不同光照处理对桃果皮着色的影响Fig.1 Effects of different light treatments on color development of peach skin

2.2 不同光照处理对桃果皮色差的影响

色差是评价果实外观色泽的重要指标。其中a*值为红绿度，正值为红色，负值为绿色，a*的绝对值越大，表明果实表面颜色越深；CIRG值是评价果实色泽、衡量果实成熟度的重要指标，与花色苷含量呈显著正相关[18]，CIRG值越大，意味着花色苷含量越高，果实颜色越深。L*值（0～100）为果实的亮度，L*值越大，说明果实表面越白亮[19]。由图2A、B可知，光照处理第2天蓝光处理组的a*和CIRG值即明显上调，与其他所有处理组均有显著差异（P＜0.05）。在后续贮藏期间，蓝光处理组a*值保持持续上升趋势，至第8天达到最大值13.87。CIRG值和a*值变化趋势一致，蓝光处理组在贮藏期结束时CIRG值达到1.01，是对照组的1.63 倍。此外，白光处理对a*值和CIRG值的提升也有促进作用，但与蓝光相比作用较弱。至第8天时其a*和CIRG值分别为3.45和0.81，仅分别为蓝光处理组的24.80%和80.00%。绿光和红光处理组CIRG和a*值则与黑暗对照组无显著差异。此外，蓝光和白光处理组的L*值与其他处理组相比显著下降，贮藏结束时蓝光和白光处理组的L*值仅分别为对照组的90%和95%（图2C），这可能与蓝光处理果实表面颜色较深造成的亮度下降有关[18]。以上结果表明蓝光和白光处理可以促进桃果皮色泽的提升，其中蓝光效果更为显著。

图2 不同光照处理对桃果皮色差的影响Fig.2 Effects of different light treatments on color parameters of peach skin

2.3 不同光照处理对桃果皮花色苷含量的影响

桃果皮的色泽变化主要是花色苷积累的结果[20]。由图3可知，各组花色苷含量整体呈现先上升后下降的趋势。第2、4天时各光照处理组与对照组之间总体存在显著差异（P＜0.05），但至第6、8天时红光、绿光处理组的花色苷含量与对照组相当，而蓝光和白光处理组则显著高于对照组（P＜0.05）。其中蓝光处理组的花色苷含量在第6天时达到峰值（27.26 mg/kg），分别是白光处理组和对照组的4.48 倍和10.34 倍。而且在整个贮藏期间蓝光处理组的花色苷含量始终高于其他处理组，其趋势与a*、CIRG值随时间变化趋势相似，表明采后进行蓝光处理能够提高‘中桃九号’果皮中花色苷含量从而促进其着色。

图3 不同光照处理对桃果皮花色苷含量的影响Fig.3 Effects of different light treatments on anthocyanin content of peach skin

2.4 不同光照处理对桃果皮中花色苷合成相关酶活力的影响

花色苷的合成需在多种酶的协同作用下完成，其通路主要分为3 个阶段。PAL是第一阶段的关键酶，能够将苯丙氨酸转化为苯丙烯酸用于下游酚类物质包括花色苷的合成；第二阶段由CHS、CHI和F3H将香豆酸辅酶A转化为二氢黄酮醇；第三阶段，二氢黄酮醇经DFR、ANS和UFGT催化最终转化为花色苷[21-24]。

由图4可知，花色苷合成途径酶活力在光照作用下发生不同程度的变化。由图4A可知，PAL活力前期持续升高，在第4天到达峰值后急剧下降。其中蓝光处理对PAL活力的提升作用显著，特别是在第4天和第6天，其PAL活力显著高于其他处理组，分别是对照组的2.13 倍和3.57 倍。其他处理组也在一定程度上提高了PAL活力，其中红光处理组在第2天和第4天与对照组之间存在显著差异（P＜0.05），白、绿光处理组在第2天和第6天与对照组之间存在显著差异（P＜0.05）。

各组CHS 活力随贮藏时间延长总体持续上升（图4B），所有处理组均在第8天到达最高值。不同光照对CHS活力影响的差异较大，其中蓝光、白光处理较对照组显著提高了CHS活力（P＜0.05），但红光、绿光处理组却与对照组之间总体无显著差异（P＜0.05）。各组CHI活力呈波动变化趋势（图4C），除第6天外，蓝光处理组在整个贮藏期内均显著高于对照组（P＜0.05）。绿、红光处理组的CHI活力在第2、4、8天时与对照组之间存在显著差异（P＜0.05），但白光处理组与对照组之间无显著差异（P＜0.05）。各组F3H活力呈波动上升趋势（图4D），其中蓝光处理在整个贮藏期间均显著高于对照组（P＜0.05），在贮藏后期与其他光照处理组之间存在显著差异（P＜0.05）。白光处理也可以提高整个贮藏期内的F3H活力，但效果不如蓝光显著。

与对照组相比，蓝光对DFR、ANS和UFGT活力的影响显著（P＜0.05）（图4E、F、G）。蓝光处理组的DFR活力在第6天到达峰值后开始下降，并在第2、6、8天均与其他处理组之间存在显著差异（P＜0.05）。其他光照处理对DFR活力并没有显著的提升作用。蓝光处理组的ANS活力在第2天达到峰值（1 441.80 U/g）后逐渐下降，且与其他处理组之间存在显著差异（P＜0.05）。其余处理组的ANS活力变化在整个贮藏期间变化趋势平缓。各组UFGT活力呈现先上升后下降的趋势，在第4、6天时蓝光处理组与其他所有处理组之间均存在显著差异（P＜0.05），分别是对照组的1.06 倍和1.08 倍。整个贮藏期间其他光照处理与黑暗对照组之间UFGT活力均无显著差异（P＜0.05）。

图4 不同光照处理对花色苷合成相关酶活力的影响Fig.4 Effects of different light treatments on enzymatic activities associated with anthocyanin biosynthesis

以上结果表明光照处理可以影响桃果皮中花色苷合成途径酶的活力，其中蓝光对所有酶的活力均有显著促进作用。

2.5 不同光照处理对桃果皮花色苷合成代谢相关基因表达的影响

为了进一步从基因层面分析光照对桃果皮花色苷代谢的影响，本实验测定了花色苷合成结构基因及相关转录因子的表达水平。

由图5可知，不同光照处理对花色苷合成相关基因的表达有不同的影响，大多数结构基因的相对表达量发生改变。光照处理后PAL的表达水平在贮藏中期显著提升，尤其是蓝光处理组，在第6天时其相对表达量与对照组相比提高了60.96 倍。CHS的表达水平则表现出与PAL不同的变化趋势，但蓝光处理同样可以提高其表达水平，在整个贮藏期内蓝光处理组的CHS表达水平均为最大值。另外，除第4天白光处理组外，光照处理可以显著提升贮藏中后期CHI和F3H的相对表达量，蓝光处理组两者相对表达量整个贮藏期间均为最高。蓝光对DFR、ANS的相对表达量也具有明显的提升作用，在整个贮藏期内蓝光处理组DFR、ANS相对表达量均高于其余4 组。蓝光处理后UFGT的相对表达量在第4、6、8天显著上调，而其余光照处理组均无明显促进作用。

图5 不同光处理对桃果皮花色苷合成代谢相关基因表达的影响Fig.5 Effects of different light treatments on the expression of genes associated with anthocyanin biosynthesis

MYB、bHLH、WD40是花色苷生物合成的重要转录因子，能够形成MBW复合体协同调控结构基因的表达，从而影响花色苷的合成[25]。在本研究中，经光照处理后的桃果中MYB10.1相对表达量从第2天起明显提高，以蓝光处理的效果为最佳。在第2、4、6天时，蓝光处理组bHLH-3的相对表达量均明显高于其他组。而光照对于WD40-1表达总体无明显的促进作用。

以上结果表明光照处理能够影响花色苷合成代谢相关的基因表达，不同的光照对于不同基因表达量的影响效果不同，但蓝光对多数基因的表达都有显著的促进作用。

2.6 桃果皮色差、花色苷含量与花色苷合成相关基因表达量的相关性分析结果

对桃果皮色泽参数、花色苷含量和合成相关基因的表达进行皮尔逊相关性分析，如表3所示，PAL、CHS、F3H、DFR、ANS、UFGT和MYB10.1相对表达量和桃果皮a*和CIRG值以及花色苷含量呈显著正相关，其中F3H、DFR、ANS和MYB10.1相对表达量与花色苷含量呈极显著正相关。

表3 色差值、花色苷含量与花色苷合成相关基因表达量的相关性分析Table 3 Correlation analysis of value of chromatism,anthocyanin content and genes associated with anthocyanin biosynthesis expression

3 讨论

本实验以‘中桃九号’为材料，研究不同光质对采后桃果果皮色泽、花色苷含量、花色苷合成途径酶活力及其结构基因和相关转录因子表达水平的影响。从表型分析结果可知，红光和绿光对于桃果色泽没有显著影响，白光有微弱的促进作用，而蓝光则明显加快了桃果的着色进程。在蓝光处理下，代表桃果皮红色色泽的a*值和CIRG值显著提升，意味着桃果皮中花色苷含量提高。花色苷含量测定结果证实了这一推测，蓝光处理组的桃果花色苷含量在第6天达到最大值27.26 mg/kg，分别是白光处理组和对照组的4.48 倍和10.34 倍。该结果与红光、蓝光处理后‘丰香’草莓的花色苷含量显著提升[26]，UV-B光照处理后蓝莓果实总花青素含量增加了10%[10]等研究结果相似，说明光照对花色苷合成的促进作用具有普遍性，但在不同植物中花色苷合成对不同光质的响应不同。本研究证实了桃果皮花色苷的合成正响应蓝光，白光对桃果皮着色的微弱促进作用主要是因为白光中的蓝光组成。

为了进一步探索蓝光促进桃果皮花色苷合成的潜在机制，本实验测定了花色苷合成途径酶活力、结构基因以及相关转录因子的表达水平，结果显示花色苷合成途径第一个酶——PAL的活力在蓝光作用下显著上升，特别是第4天时，达到对照组的2.13 倍。其编码基因的表达水平也在蓝光作用下显著上调，并于第6天达到最大值。这说明蓝光能够加速苯丙氨酸向下游包括花色苷在内的酚类物质的转化，这与光照促进红阳猕猴桃[27]、甜樱桃[28]和草莓[29]中PAL活力提高相同。CHS、CHI和F3H处于花色苷合成通路第二阶段，负责将香豆辅酶A转化为黄烷酮[30]。在本研究中，除了白光处理组CHS活力与蓝光处理组没有显著差异之外，蓝光处理组的CHS活力在大多数时间点均显著高于其他处理组。基因表达分析结果与酶活力分析结果类似，这与1-甲基环丙烯、热空气和UV-C处理后CHS、CHI和F3H的表达模式相同[31]，表明这3 种酶在为花色苷合成提供二氢黄酮醇前体物质中发挥至关重要的作用。DFR、ANS和UFGT是花色苷合成第三阶段的酶，与花色苷的形成及稳定性息息相关[32]；在蓝光作用下，这3 种酶活力和编码基因表达水平均明显上升。其中DFR活力在所有酶活力中处于最高水平，意味着DFR催化的二氢黄酮醇转化为无色花色素的反应是花色苷合成的重要步骤。UFGT是花色苷合成通路的最后一种酶，通常被认为是花色苷合成的限速酶[33]。在本研究中，蓝光处理后第4天开始，UFGT活力及其编码基因表达水平显著提升，这与光照上调李子[34]和葡萄[35]中UFGT基因表达的结果相同，同时也进一步证实了UFGT在花色苷合成中的重要地位。转录因子MYB、bHLH和WD40同样也参与了桃果花色苷的合成，它们通过形成MBW复合体协同调控花色苷合成结构基因的转录[36-37]。在蓝光作用下MYB10.1表达水平在第8天明显提升，bHLH3表达水平在前6 d均明显高于其他处理组。桃果皮色泽参数、花色苷含量和合成相关基因表达的相关性分析结果表明，蓝光处理可能通过上调转录因子MYB10.1及其下游花色苷合成结构基因的表达，进而提升代谢途径酶活力，促进花色苷的合成和积累，最终导致色泽的提升。

蓝光对桃花色苷合成的这种促进作用和桃中的蓝光信号转导通路相关。植物在长期的进化过程中形成了一套复杂而精密的光信号转导通路，以适应自然环境中光线的变化[38]，光受体蛋白在这一过程中起重要作用。在拟南芥中，感知和接收蓝光的受体蛋白为隐花色素（cryptochrome，CRY），该蛋白通过与下游蛋白结合传递光信号，进而调节下游蓝光响应基因的表达，调控相关生理过程[39]。在桃中，研究人员发现了CRY同源蛋白PpCRY2，该蛋白序列中包含隐花色素所有蛋白功能域[40]。蓝光处理显著增强了PpCRY2编码基因的表达，进一步证明了PpCRY2作为光受体蛋白的特性[40]。光受体激活后，通常会与相关转录因子启动子结合并对其进行转录激活，进而引起下游花色苷合成结构基因的表达上调。在本研究中，MBW调控复合体蛋白编码基因的表达水平在蓝光处理后均显著上调。生物信息学分析结果显示其启动子序列中存在响应光照的顺式作用元件——光调控元件（light regulatory unit，LRU）[41]，提示隐花色素可能会结合到MBW复合体成员的启动子激活其表达，或是通过其他转录因子介导间接调控其表达。有关桃中蓝光激活花色苷合成的信号转导机制目前尚未完全清晰，还需后续进一步研究。此外，在桃基因组中，研究人员发现有光敏色素等其他光受体蛋白序列，这表明桃对红、绿光也有响应，但可能与花色苷代谢无关，而是涉及到生长发育的其他方面，包括趋光性、抗逆性、抗氧化性等[42]。

综上，不同光照处理对采后桃果的着色影响不同。其中蓝光处理能够上调桃果皮中花色苷代谢调控因子MYB10.1及其下游结构基因的表达，从而提高花色苷合成途径酶活力，加速代谢诱导花色苷的合成和积累，最终表现为桃果皮色泽的显著提升。此外，不同光照处理对桃果实硬度没有明显影响，仅在个别时间点对可溶性固形物和可滴定酸含量有提升作用。本研究结果有助于加深对光照调控植物花色苷代谢机制的理解，同时可为研发桃采后色泽调控技术提供理论依据，对保障我国桃产业的可持续发展具有一定的现实意义。