前交叉韧带重建术后移植物愈合的研究进展

王云鹭，李锡勇，刘伦，张鹏，韩鹏飞，李晓东*

(1.长治医学院研究生院，山西 长治 046000；2.长治市第二人民医院骨科，山西 长治 046000；3.长治医学院附属和平医院骨科，山西 长治 046000)

据流行病学统计[1]，前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)损伤的发病率约为每年20万例，若未及时治疗，患侧膝关节易反复扭伤，进而引起关节软骨和半月板等解剖结构的损伤和退变，导致创伤性膝关节骨关节炎的发生。根据形态学的特点可将ACL损伤分为3级，1级：韧带的完整性良好；2级：韧带的连续性部分中断；3级：韧带的连续性完全中断。其中3级ACL损伤可导致膝关节严重不稳定，需要及早一期重建和恢复膝关节稳定性，而前交叉韧带重建术(anterior cruciate ligament reconstruction，ACLR)是目前ACL损伤或完全断裂的最佳术式之一。目前，每年进行ACLR手术患者例数为6～10万例，其中，大多数研究报道目前ACL移植术后的移植失败率在0.7%～14%之间[2]。有证据表明，愈合不良可能是ACLR失败的主要影响因素之一。van Eck等[3]的一项研究表明，在单束ACLR术后行翻修手术时最常见的ACL断裂部位是在近端，其次是中段，并且将ACL移植失败的原因归结为手术技术、再发创伤以及移植物不愈合[4]。Group等[5]一个多中心前瞻性研究，也得到了类似的结论。由于手术技术[6]和康复方法的进步[7]，当ACLR术后没有再发创伤性事件却依然发生移植物失败时，应考虑移植物愈合的问题。因此，需要更好地理解ACLR生物愈合的过程。

ACLR术后移植物愈合过程通常被分为3个阶段，即早期愈合、浸润增殖和基质重塑[8]。移植物早期愈合阶段以移植物坏死和细胞缺乏为特征，没有任何明显的血运重建，随后是细胞浸润最密集的增殖阶段，最后是缓慢的基质重塑阶段。理想化的ACLR肌腱移植在骨隧道内牢固愈合的同时，需要术后尽快在关节内区域达到完全“韧带化”，从而促进早期功能锻炼和快速康复。因此，如何增强肌腱移植物的愈合对于ACLR成功与否至关重要[9]。然而，尽管多年来，不同的研究尝试通过多种生物调节方式，以改善移植物的愈合，但是仅观察到Sharpey纤维通过纤维软骨区，并未获得真正骨隧道完全闭合和骨化，以及移植物关节内区域的“韧带化”等临床结果。

1 移植物的愈合过程

移植物愈合过程是炎症反应、移植物坏死、血运重建、细胞再生、骨长入、胶原重塑和韧带化等多种生物事件的组合，并可被大致分为三个不同的阶段：即早期愈合、浸润增殖和基质重塑阶段。

1.1 早期愈合阶段 有研究表明，ACLR术后早期细胞反应涉及宿主炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)的招募和炎症因子(如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β)的释放。移植物植入后不久，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-13水平升高，在消化胶原蛋白的同时帮助再生的细胞浸润。同时，研究人员一致认为ACLR移植物早期愈合阶段中心部分易发生缺血性坏死，导致一些细胞因子被释放并启动生长因子的级联。与隧道内部分不同，移植物关节内部分暴露在滑液中，而滑液中含有大量的催化酶、细胞因子和生长因子抑制剂，会进一步干扰愈合过程。这些变化可能导致早期愈合阶段缺血坏死、胶原紊乱(崩解或碎裂)、黏液样变性，如果持续下去，可能导致移植物愈合失败。因此，充分了解ACLR术后早期愈合阶段的细胞和生化反应是很重要的。目前，临床上大多在ACLR术后立即给予患者环氧化酶(cyclooxygenase，COX)-2抑制剂或非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID)，在减少术后的疼痛和肿胀症状的同时，避免移植物早期愈合阶段不良因素的影响[10]。

1.2 浸润增殖阶段 由于ACL移植物在植入后会发生坏死，因此充分的血运重建对移植物愈合过程中细胞再生和随后的基质重塑至关重要。研究人员已经证实了自体移植物的血供和血管重建在维持移植物活力方面的重要性[11]。而血管重建早在植入后3周就完成了，甚至浸润到自体移植物的中心部位[11]。这提示新生的血管可能是从滑膜和髌下脂肪垫发育而来，因此在手术中保留这些组织是非常必要的。也有证据表明[12]，与标准ACLR相比，术中保留原有ACL残端，术后患者膝关节稳定性更好，临床结果也更好。本体感受信息通过肌肉、肌腱和关节中的感受器记录，本体感觉提供有关身体部位、身体在空间中的位置和运动情况以及运动条件变化的信息。ACL本身不仅具有其生物力学功能，而且还具有一定的本体感觉功能。与不保留残端的ACLR相比，保留残端可最大化保留ACL组织，使残端包裹移植物的同时，加快移植物的血运重建，更好地封闭骨隧道，减少滑液进入导致的骨隧道扩大，从而促进移植物肌腱-骨之间的愈合，更利于本体感觉和术后膝关节功能的恢复。另外，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达与重建后血管密度的高低有关，而在体内观察到VEGF的产生可能是由肌腱移植物的炎症反应引起的[13]。

1.3 基质重塑阶段 骨隧道的微环境类似于骨折的环境，而骨隧道壁的变化也与软骨内成骨的过程相似。有研究表明，骨长入在移植物骨愈合过程中起着重要的作用，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP；BMP-2、BMP-7)特异性地参与了导致骨长入和骨整合的基质重塑过程[14]。一些研究已经证实，除BMP-2、BMP-7以外，骨传导剂如钙-磷酸盐骨水泥以及破骨细胞抑制剂也已被认为可用于改善肌腱移植周围骨生长的潜在应用[15]。

在上述整个愈合过程中，Smith等[16]通过进行前抽屉试验，随访观察ACLR使用同种异体胫前肌肌腱移植术后12个月中每月膝关节松弛度的增加情况。结果显示，术后6个月时膝关节松弛度增量最大，这与移植物骨愈合过程的时间轴(早期愈合阶段结束和浸润增殖阶段开始之间)吻合。而在浸润增殖后期和随后的基质重塑期，膝关节松弛度并没有再增加。因此，根据3个不同的阶段(早期愈合、浸润增殖和重塑成熟)和2个不同部位(关节内部分和骨隧道部分)出现不同的宿主和移植物反应，从反应发生的时间和地点上更好地理解和区分移植物愈合过程，对于理解和促进ACLR移植物愈合等相关研究大有裨益。

在早期愈合阶段，宿主的炎症反应和移植物的细胞坏死在ACLR术后立即发生。在下一阶段浸润增殖的过程中，根据移植物周围的环境，不同类型的细胞被招募到骨隧道内(成骨细胞)和关节内(成纤维细胞)。这些细胞通过新生血管重新浸润填充坏死的移植物组织以获得营养供应。随后的重塑成熟阶段，这些再生细胞在机械负荷和生物化学的影响下，介导移植物不同区域(骨隧道内的肌腱-骨界面愈合和关节内区域的韧带化)内的基质重塑过程。

与ACLR术后移植物愈合的传统概念相反，作者强调移植物周围环境的区域性差异影响了基质重塑过程。因此生物调节也应针对有利于细胞再生或基质重塑方面进行研究，以尽可能恢复ACL的原始生物学功能。

2 移植物愈合的生物调节

2.1 自/异体移植物的愈合差异 自体肌腱具有优异的生物力学特性，其结构更接近于健康ACL的解剖结构，具有较强的固定强度。随着肌腱-骨愈合过程的进行，骨在骨隧道内逐渐与移植肌腱相结合，同时在肌腱与骨之间形成胶原纤维，这些纤维类似于正常固定在肌腱-骨之间的Sharpey纤维，使肌腱牢固固定于骨上。肌腱-骨经过24周后组织上显示正常的过渡带，提示移植物愈合[17]。肌腱-骨连接处的力学实验表明，12周内两者之间的结合强度逐渐增加，此后肌腱-骨连接处的强度停止增加[17]。

由于ACL具有特殊的胶原纤维排列及卷曲结构、独特的起止点几何外形及韧带-骨移行区，异体肌腱移植后只能部分恢复ACL的功能。异体肌腱在移植后4～6周内发生滑膜样变过程，其中移植物内的缺血带发生缺血坏死，而新生血管化的滑膜组织则包裹着移植物[18]。在缺血坏死和血运重建阶段，移植物膜样组织为其血运重建提供来源，从髌下脂肪垫和滑膜穿出的骨血管为其血运重建提供支架，异体肌腱在骨隧道内经历韧带化过程，通过致密结缔组织固定在骨隧道壁上，最终移植物愈合[17]。尽管异体肌腱的血运重建过程需要20周，但由于异体肌腱具有免疫原性，与自体肌腱相比具有相应较长的炎症期过程，其重塑过程则需要更长时间(大于自体肌腱移植物愈合的24周)[18]。

2.2 生物调节部位 间充质干细胞、生长因子、生物材料和物理干预等这些生物调节方式或物质已被多项研究报道，应用于改善ACLR术后移植物的愈合结果，且绝大部分靶向作用于骨隧道区域内的肌腱-骨界面愈合[19]。然而据临床报道，ACLR移植物断裂最常发生部位在股骨插入处，其次是关节内中间区域[3]。动物研究也显示出同样的结果[20]。ACL重建成功与否取决于移植物和骨隧道之间的愈合过程。早期愈合过程中的薄弱环节是骨和肌腱之间的附着部位(肌腱-骨界面)，纤维血管组织在移植物和骨隧道内壁之间的界面处形成，胶原纤维随后附着在肌腱-骨界面处，肌腱和骨骼通过特征锚定纤维(Sharpey样纤维)直接连接。移植物的缺氧状态可能导致潜在的骨隧道增宽和移植物松弛，限制康复和恢复活动。肌腱-骨愈合在ACL重建中界面的整合过程中起着至关重要的作用。因此，需要更多关注如何通过调节生物事件来改善移植物关节内中间部分的愈合效果。

2.3 生物调节的理想化目标 移植物模拟天然ACL的力学强度作为影响ACLR手术最重要的结果之一，学者们总是在努力但从未达到过理想化目标。McFarland等[21]建立的犬ACLR模型，术后4个月的移植物强度仅为天然对照组的40%。Ng等[22]检测了山羊ACLR术后3年的生物力学数据，结果显示移植物的强度和刚度分别仅为天然ACL的44%和49%。Clancy等[23]对恒河猴ACLR模型的研究显示，肌腱移植物的抗拉强度约为转移前的80%。而Fu等[20]在大鼠、Blickenstaff等[24]在新西兰白兔等动物模型中发现，与天然ACL相比，ACLR移植物的强度仅为20%左右。

2.4 生物调节措施 以细胞补充为例，移植物愈合的增殖阶段是通过移植物中的细胞浸润和再生来完成的。为了增强细胞再生，既往研究使用了间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)、脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells，ADSC)、ACL源性细胞、滑膜细胞和骨膜祖细胞，并研究了它们对ACLR移植物愈合的影响[25]。其中，最常用的干细胞生物调节方法是直接在关节内区域和/或骨隧道内注射或包埋入纤维蛋白胶中[25]。而Hur等[26]的研究表明，与直接注射或纤维蛋白胶技术相比，细胞薄片技术是一种更优越的将干细胞输送到ACLR移植物的操作技术。此外，为了实现愈合过程中生长因子的持久和稳定的表达，学者们还将基于干细胞的基因治疗引入了ACLR愈合相关研究中[27]。VEGF是一种内皮有丝分裂原，可促进血管生成，增加血管通透性，并在ACLR术后早期促进肌腱-骨纤维整合。从间充质组织(即骨髓)获得的MSC可以分化为再生不同组织(如骨、软骨、肌腱、韧带和脂肪)所需的各种细胞类型(即成骨细胞、成纤维细胞)。生长因子也显示出能够调节和改善细胞增殖、分化和基质沉积，并影响MSC分化为成纤维细胞以修复撕裂的韧带。生长因子对改善ACL愈合所需的各种生物过程显示出积极作用。通过自分泌或旁分泌作用靶向细胞的MSC的增殖，增强了骨诱导并最终促进了肌腱-骨愈合。

3 移植物愈合的监测技术

3.1 核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI) 在临床上，MRI是最常用的监测ACLR术后移植物愈合过程的影像学技术。Howell等[28]进行了一项前瞻性研究，连续观察ACL自体移植物术后1年的MRI表现。结果显示，MRI移植物信号增强具有时间依赖性，移植术后3个月形态良好，术后1年时MRI信号增强，且被认为与移植物水肿有关。另外，通过T1加权像下给药Gd-DPTA造影剂后MRI增强扫描来评估移植物血运重建程度，结果显示尽管韧带周围软组织血管丰富，但ACL移植物在植入2年期间没有明显的血供[29]。然而，Li等[30]评估了ACL移植物的MRI信号/噪声系数(signal/noise quotient，SNQ)，在术后3、6和12个月以及9年ACLR移植物SNQ值与术后时间呈显著负相关。如上所述，由于广泛异质性的存在，各项移植物愈合的MRI研究结果存在很大差异，未来需要进一步客观定量研究移植物愈合过程的MRI生物标志物的出现。

3.2 计算机断层扫描(computerized tomography，CT) 鉴于普通X线片通常难以可靠地识别和测量ACLR骨隧道的宽度，故CT已被推荐用于评估ACL移植物愈合过程中的骨隧道变化。Suzuki等[31]通过CT扫描对使用骨-髌腱-骨移植物进行的ACLR手术评估，发现术后8周移植物几乎完全融入股骨矩形隧道。Fink等[32]使用CT连续监测ACLR术后2年内骨隧道的变化过程，发现术后6周隧道变化明显高于其他时间，而1年后隧道宽度基本稳定。对于自体腘绳肌腱行ACLR，术后平均随访10个月，CT扫描显示股骨隧道直径增加3%，并可显示硬化的隧道边界。因此，随着CT技术的不断发展，其可以准确地评估ACLR术后骨组织和软组织的变化。

3.3 膝关节镜复检与组织活检 由于MRI和CT等非侵入性方法可以获得的移植物愈合信息仍然有限，ACLR术后的膝关节镜复检成为较可靠的移植物愈合监测方式，能够提供ACL移植物滑膜化和血管化等有价值的信息。Nakamae等[33]在ACLR术后18个月通过关节镜复检证实移植物的滑膜覆盖范围明显改善。滑膜化在移植物愈合中起着重要作用，并被认为对移植物的存活有积极的影响。此外，关节镜还可通过获取活检样本进行组织学检查来研究ACL移植物的愈合过程[34]。有研究表明[35]，ACLR术后6个月时移植物表面血流量明显高于对照组，12个月时达到平稳期，并保持与正常ACL相当的水平。虽然膝关节镜复检与组织活检可以显示移植物愈合过程中滑膜、血管和其他组织水平的变化，但限于是一种侵入性技术，故不能作为常规手段对愈合过程进行随访。

综上所述，尽管通过三个阶段(早期愈合阶段、浸润增殖阶段和基质重塑阶段)，以及宿主和移植物在两个不同部位(关节内和骨隧道内)的反应，更清晰地描绘了ACLR移植物的愈合过程，但是如何更精确地在特定的时间段和部位通过生物调节发挥其在改善ACLR移植物愈合方面的潜力并获得预期成果，未来仍需要更多高质量的深入研究(精确调节愈合目标阶段)来进一步印证并提供新的思路。