白念珠菌药物耐受机制研究进展

黄宇颖 刘维达,2 李筱芳,2

(1.中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所真菌科,南京 210042; 2.江苏省皮肤病与性病学分子生物学重点实验室,南京 210042)

念珠菌引起的侵袭性感染严重威胁人类健康,全球侵袭性念珠菌感染病例每年有约70万例,是重症监护室患者血流感染的常见病因。而世界范围内大部分地区,白念珠菌仍为侵袭性念珠菌的主要病原体[1-2]。成年人念珠菌血症死亡率达40%～70%,新生儿念珠菌血流感染后的死亡率达20%～34%[3]。目前治疗白念珠菌感染的药物种类有限,主要为唑类、多烯类和棘白菌素类,但随着临床上的广泛使用,耐药(drug resistance)菌株的报道越来越多。此外,在持续性念珠菌血症中,即使采用体外药敏试验提示敏感的药物进行治疗,也常常伴随迁延不愈和复发,死亡率显著高于非持续性感染[4],这种临床疗效和低耐药率不一致的情况可能与其药物耐受性(drug tolerance)有关[5-6]。白念珠菌的耐受问题使临床治疗面临严峻挑战,因此了解白念珠菌耐受的概念、机制及其与耐药之间的联系至关重要。

1 白念珠菌药物耐受的概念

真菌的耐受是敏感菌株的一个特征,定义为敏感株在最小抑菌浓度(minimal inhibitory concen-tration,MIC)以上的高浓度药物中缓慢生长的能力[9]。药敏试验中,琼脂扩散法抑菌圈内少量菌的生长或微量液基稀释法的拖尾现象都是真菌对药物耐受的体外表现[7]。在念珠菌中,氟康唑治疗的白念珠菌耐受的概念和量化研究最为广泛。有研究对分离自不同部位的66株白念珠菌进行氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的药敏实验,仅发现2株耐药菌,但大部分菌株均存在拖尾现象[6]。Rosenberg等[6]采用琼脂扩散法的生长分数(fraction of growth,FoG)和微量液基稀释法的超MIC生长指数(supra-MIC growth,SMG)(见图1)更为精确地分析了219株不同感染来源的白念珠菌,发现均存在三唑类药物耐受现象,棘白菌素和多烯类相对少见;不同菌株的耐受程度不一样,体现在高于MIC时生长的亚群规模和菌落出现的速度存在差异;219株白念珠菌的FoG值变化范围为0.10～0.85,耐受程度越高,FoG越大,并与SMG值保持一致。

2 白念珠菌药物耐受机制的研究

目前对白念珠菌耐受机制的研究主要包括以下四个方面。

2.1 压力应答调控

目前认为耐受是一种应激策略,对药靶没有直接影响,压力应答调控被认为是耐受的重要方式之一[7]。压力应答调控的关键因子热休克蛋白90(Hsp90)、钙调磷酸酶、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、Rim101和雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)通过Ca2+-钙调磷酸酶、PKC-MAPK、Rim途径和HOG信号通路来调控白念珠菌的压力应答,以对唑类、多烯类和棘白菌素类药物产生适应性[9]。这些压力应答调控因子的抑制剂和突变体可以有效地消除白念珠菌耐受性,并提高氟康唑对一组不同耐受水平菌株的抑菌活性[10-13]。与此一致,Hsp90、钙调磷酸酶、TOR、赖氨酸去乙酰化酶或Rim101基因功能破坏可增强氟康唑的作用[14]。值得注意的是,抑制这些压力应答途径并不影响菌株的MIC水平,因此推测白念珠菌的耐受性水平与这些途径相关[15]。除上述的核心压力应答途径外,还有许多其他途径和信号蛋白参与耐受现象的产生和维持,例如白念珠菌中的转录因子Cas5 在细胞壁压力应答中发挥作用,并参与对棘白菌素的耐受[16]。参与翻译后修饰的酶也参与压力应答调控,其中研究较多的是调节白念珠菌对唑类敏感性的赖氨酸乙酰转移酶(lysine acetyl-transferase,KAT)[17]。白念珠菌中Spt-Ada-Gcn5-乙酰转移酶 (Spt-Ada-Gcn5-acetyl-transferase,SAGA) 复合物的共激活因子Ada2功能破坏可导致药物外排泵表达上调,除了影响耐药性之外,还部分影响白念珠菌的耐受程度[18-19]。另有研究发现在同一MIC水平不同耐受程度的白念珠菌中,高耐受菌株细胞内氟康唑含量低于低耐受菌株[6],因此某些压力应答调控途径可能部分影响药物的摄取和外排,并间接地促进菌株对氟康唑的耐受。

2.2 非整倍体形成及杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)

真菌病原体基因组具有显著的可塑性,能够通过基因组修饰来适应环境干预。基因组修饰不仅可以导致耐药,也可以使白念珠菌敏感株产生药物耐受。研究发现白念珠菌暴露于唑类药物中数小时后,其有丝分裂的细胞周期及纺锤体数目出现异常,产生四倍体和非整倍体细胞[20]。而非整倍体细胞可以改变白念珠菌对氟康唑的耐受性,例如3号染色体右臂形成的三倍体使白念珠菌敏感株对氟康唑存在的环境产生更高的适应性但不改变其MIC值,并观察到该节段上编码尿素转运蛋白的NPR2基因拷贝增加[21]。值得注意的是,由于非整倍体同时影响多个基因,因此它可能赋予同一细胞多种表型,例如2号染色体形成的三倍体可以对羟基脲及卡泊芬净产生交叉适应性,即预先暴露于羟基脲中的白念珠菌在卡泊芬净中的存活率也大大提高。此外,白念珠菌中5号染色体形成的单倍体可同时对氟康唑和卡泊芬净产生耐受[22]。最近一项研究表明,R染色体非整倍体形成是白念珠菌对唑类药物耐受相关性最大的非整倍体。遗传多样性往往是在适应压力的过程中产生的,Forche等[23]发现白念珠菌暴露于氟康唑、H2O2及高温等环境中,其LOH率显著升高,通常这类菌株对环境的适应性增加。

2.3 环境因素及生理代谢

白念珠菌的耐受水平除了受遗传因素影响外,还受生长环境等物理因素的影响。pH值、温度以及培养基成分均可影响白念珠菌对氟康唑的耐受水平。已有研究表明在pH值为中性的培养基上白念珠菌的拖尾现象较pH值低的酸性培养基更明显[24]。最近的研究发现大部分白念珠菌在体温(37 ℃)下生长的耐受水平高于实验室温度(30 ℃),并且在YPD培养基上耐受程度高于RPMI-1640培养基[25]。此外,在棘白菌素类药物存在的情况下,增加细胞壁几丁质成分促进细胞的存活[26],而添加钙调磷酸酶抑制剂则降低菌株对棘白菌素类药物的耐受性[27]。氟康唑联合多西环素可降低白念珠菌的耐受性并具有杀菌作用,此效应依赖于多西环素结合培养基中铁离子导致的铁离子耗竭,并可以通过添加铁离子逆转。因此,铁离子稳态与白念珠菌耐受性之间存在关联[28]。

2.4 液泡的发生发育

在白念珠菌中,参与逆行转运的因子VPS21、VPS15、VPS51和Rim101可能通过调控液泡转运途径中关键因子的转录,对其耐受程度产生影响。该研究推测液泡的发生发育与甾醇稳态相关,也证明了白念珠菌的药物耐受性更多依赖于细胞内的生理过程[29-30]。

3 耐受与耐药的区别与联系

目前白念珠菌的耐药是研究热点,而耐受在临床中常常被忽视。白念珠菌中耐受细胞与耐药细胞虽然都有在药物存在的环境中生长的能力,但前者的MIC值常在“临床折点”之前,被定义为敏感株;而后者的MIC值则在“临床折点”之后,被定义为耐药株。在氟康唑诱导白念珠菌敏感株产生耐受与耐药的实验中发现,耐药更容易在浓度与MIC值相近的药物环境中被诱导,而耐受则更容易出现在超MIC值(即为MIC值5～10倍以上)的高浓度药物环境中[25]。此外,在含氟康唑的培养基上,耐药株较耐受株出现的时间更早,菌落更大。耐药株在含药培养基上的生长量与其在空白培养基上生长量相当,而耐受株在含药培养基上的生长量少于其在空白培养基上生长量[6,31]。越来越多的研究提示耐药和耐受的机制不同,由不可逆转的基因突变导致的稳定性MIC值升高是耐药的主要机制和表现,而耐受机制目前认为主要以表观遗传修饰和生理代谢因素为主。另外,不同菌株之间耐受水平的差异是由于菌株之间的基因多样性;而在特定的分离株中,只有部分亚群可以在超MIC药物浓度中缓慢生长则是由于同一菌株不同细胞之间的生理或代谢变化差异[28]。

有学者提出白念珠菌的耐受性在一定程度上可增加其耐药突变的频率,该观点基于以下观察结果：在氟康唑存在时,抑制Hsp90不仅可以消除白念珠菌的耐受性,还能使氟康唑产生杀菌效应;高耐受水平的菌株分裂频率高于低耐受水平的菌株,因此其获得耐药基因突变的可能性也更高[6,32]。Levin-Reisman等[33]也证实了耐药突变产生于病原菌的耐受亚群,耐受是耐药的重要前提和基础。

图2 典型药敏试验中抗真菌耐药和耐受性的行为图示

4 小结与展望

白念珠菌的耐药问题目前研究已十分广泛,但其耐受性对疗效的影响在临床中常被忽略。近年来发现耐药并不是白念珠菌抵抗药物的唯一策略,临床疗效和低耐药率不一致的情况可能和药物耐受有关。本综述系统阐述了耐受的概念与机制,并指出其与耐药的区别与联系。阐明耐受产生的具体机制并发现其抑制剂将成为临床治疗念珠菌感染的潜在靶标,因为其不但可以增加药物疗效,并最终可能延缓耐药性的发展。