於怀龙,张秀华,邵华荣,刘英梅,张小刚,郭新艳,刘 飞
(山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室,山东 济南 250101)
骨质疏松症是一种常见的骨骼疾病,影响着全球约2亿患者,世界卫生组织将骨质疏松症定义为“以骨量低和骨组织微结构退化为特征的进行性系统性骨骼疾病”[1]。骨质疏松症分为两类:原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症,原发性骨质疏松是随着年龄的增长而发生的一种退行性病变,继发性骨质疏松是因为某种疾病或其他原因而导致的骨质疏松[2]。骨质疏松症治疗需要以个体为基础,综合考虑给药方案的安全性、有效性和成本,以达到预期的疗效[3]。因此了解骨质疏松症的分子机制对于开发有效的治疗方案非常重要。
人体正常骨重建进程中,成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收处于动态平衡状态,以维持骨代谢中正常的骨稳态[4],而骨质疏松患者中这种平衡被打破,破骨细胞活性超过成骨细胞,导致骨吸收增加,骨皮质变薄,骨小梁消失,骨质变差,进而易引发脊柱和髋部及长骨等部位骨折。为了维持骨内稳态,需要多种因子、细胞和通路共同参与,以协调成骨细胞和破骨细胞的功能[5]。本文总结了成骨细胞和破骨细胞调控骨重塑的分子机制,以及治疗骨质疏松症的靶点,为骨质疏松症药物的开发提供参考。
骨重塑是破骨细胞和成骨细胞分别独立降解旧骨和形成新骨的过程,这个过程对人体骨内环境稳定至关重要,它涉及骨形成和骨吸收的平衡协调,以支持骨量和全身矿物质内环境稳定。骨重塑可分为5个阶段:激活期、骨吸收期、逆转期、成骨期和终止期[6],这些过程在骨架内的多个位置同时但异步进行。控制破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成的重要分子信号包括:核因子κB(NFκB)、NF-κB受体激活剂(receptor activator of NFκB,RANK)、NF-κB受体激活剂配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)、破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG)和典型的Wnt信号通路等。同时该过程还受旁分泌调节因子(如细胞因子、生长因子、前列腺素)和内分泌调节因子[如甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、降钙素、维生素D、糖皮质激素、生长激素和性激素]的调节[7]。转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和RANKL等局部调节因子,和维生素D、钙、甲状旁腺激素、性激素等系统调节因子[6],共同维持人体骨骼局部和全身内环境平衡稳定。
成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,负责骨基质的合成、分泌和矿化。成骨细胞分化分为3个不同的阶段:骨祖细胞、前成骨细胞和成骨细胞[8]。骨祖细胞的形成标志是转录因子 SRY相关盒基因9(SRY related box-9,Sox9)的表达,然后骨祖细胞随着runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)在其细胞中的表达,向成骨细胞发育[9]。成熟阶段的前成骨细胞受Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号诱导表达成骨细胞特异性转录因子Osterix(Osx),该因子和RUNX2是成熟成骨细胞形成的标志[9]。在骨骼维护的过程中成骨细胞还表达分泌其他信号分子,如骨钙素、RANKL、OPG、Osx、增强子结合蛋白、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)、叉头盒蛋白O(forkhead box protein O,FoxO)和核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)等,这些分子通过信号通路严格控制骨重塑过程。
Wnt/β-catenin信号通路是一个进化上保守的细胞通讯系统,在干细胞更新、细胞增殖和细胞分化中起着重要作用。Wnt信号通路可分为两种途径:典型的β-catenin依赖性途径和非典型的β-catenin非依赖性途径。遗传或表观遗传变化降低或过度激活Wnt/β-catenin信号可导致人类疾病,如骨质疏松症[10]。Wnt蛋白是分泌型糖蛋白家族的成员,在成骨细胞分化过程中起着关键作用,Wnt10a和Wnt10b的过度表达可通过典型的β-catenin依赖途径极大地稳定β-catenin,刺激细胞向成骨细胞分化,并抑制脂肪生成。Wnt6相较Wnt10a和Wnt10b刺激成骨细胞生成的作用较弱,但研究显示Wnt6基因敲除会增强前脂肪细胞分化,削弱成骨细胞生成[11]。
Wnt 信号通路受分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein,sFRP)、Dickkopf-1(DKK1)和硬化蛋白等抑制剂调节。sFRP作为Wnt的诱饵受体,能结合Wnt和卷曲(frizzled,Fz)受体以干扰Wnt信号传导。低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor related protein,LRP)广泛表达于细胞表面的分子,是Wnt蛋白的共受体,研究显示LRP5基因表达的缺失或增加影响着骨骼的形成,能导致骨质疏松或骨质增生[12]。DKK1能通过与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)的BP1和BP3结构域结合,并与跨膜蛋白Kremen1/2形成复合物,增加LRP5/6的内化,从而抑制经典Wnt途径,减少骨量生成。硬化蛋白同样可通过与LRP5/6及LRP4受体相关蛋白的BP1结构域结合,阻断经典Wnt信号途径,抑制新骨形成[13]。Jia等[14]已证实硬化蛋白抑制剂对骨合成代谢的调控非常有效,可增加骨形成和骨密度,并降低患者骨折风险。
RUNX2是转录因子RUNX家族的一员,参与成骨细胞分化、软骨细胞成熟及破骨细胞生成等骨骼形态发生过程。RUNX2对于成骨细胞的成熟,以及膜内和软骨内的骨化至关重要,RUNX2的表达是间充质干细胞向成骨细胞分化的充分必要条件[15]。RUNX2能调控众多因子转录,如在成骨细胞中RUNX2可通过调节Osx的表达,诱导前骨细胞向成骨细胞分化[16];调节成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)2和FGFR3的表达,促进成骨细胞和祖细胞的增殖[17]。RUNX2还可通过结合启动子或增强子的核心位点来调节骨钙蛋白、Osx蛋白、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)和T细胞受体增强子等不同基因的转录,完成间充质细胞对成骨细胞系发育的控制作用[18]。但RUNX2的过度表达会抑制成骨细胞的成熟,降低I型胶原和骨钙蛋白的表达,导致成骨细胞停滞在未成熟阶段[19]。
骨钙素,也称为骨γ-羧基谷氨酸蛋白,是一种由成骨细胞分泌的非胶原、维生素K依赖性蛋白[20]。骨钙素合成后在17,21,24 3个位点进行谷氨酸羧基化修饰,修饰后的骨钙素可与游离的钙离子和羟基磷灰石结合,通过与I型胶原相互作用来维持骨的结构特性。间充质干细胞中骨钙素基因缺失会延迟骨矿物质的成熟,降低骨中钙和羟基磷灰石含量,引起骨质疏松。
Osx 是一种锌指蛋白,属特异性蛋白(specifieity protein,Sp)/ Krüppel样因子(KLF)[21],与成骨细胞分化和骨形成有关,是成熟的成骨分化所必须的因子,可触发未成熟的成骨细胞分化为成熟的成骨细胞最终分化为骨细胞[22]。Nakashima等[23]证实在Osx缺失的小鼠中,间充质细胞无法沉积骨基质,骨膜中的细胞也无法分化为成骨细胞。在成人骨中,成骨细胞中Osx的失活降低了腰椎的骨密度和骨形成率,减少了长骨长度,使皮质骨更薄、更多孔,但未成熟小梁骨增加。虽然骨骼中的Osx失活会在成骨细胞中产生功能缺陷,但不会影响成骨细胞增殖或破骨细胞形成[24]。Lee等[25]发现敲除MC3T3-E1成骨细胞中的Osx基因,成骨细胞的细胞分化和结节形成显著减少。Osx基因的敲除使15个与细胞分化相关的基因上调,2个基因下调, 15个上调基因中,原纤维蛋白2和骨膜蛋白的表达显著增加,表明原纤维蛋白2和骨膜蛋白可作为Osx在成骨细胞分化中的候选靶点[26]。
BMP是属于TGF-β超家族的生长因子,可促进间充质干细胞向成骨细胞分化,目前已鉴定出的BMP有20多种,它们不仅可促进骨的形成,在心脏生成、神经生成、眼睛形成及脂肪生成和软骨生成中也发挥着重要作用[27]。目前的研究已显示BMP2和BMP4在成骨细胞分化中是必不可少的,被认为具有改善患者骨折愈合治疗效果的潜力。在Dkk1过度表达和Ctnnb1(编码β-catenin基因)条件性敲除的情况下,BMP2诱导异位骨形成的功能被拮抗,BMP2可能通过上调LRP5蛋白表达和稳定β-catenin蛋白诱导成骨细胞定向分化与增殖[28-29]。且BMP2还与机械刺激信号相互作用,最终作用于Hippo信号通路的重要转录因子YAP/TAZ(原癌基因Yes相关蛋白/转录共激活因子),激活成骨基因并驱动成骨分化,参与骨软骨生长发育及其重建过程,加速骨缺损修复[30-31]。
FoxO是一种转录因子,主要参与细胞凋亡、DNA修复和清除活性氧自由基过程。哺乳动物中FoxO包括4个成员:FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6,其中FoxO1在骨骼肌中表达丰富,FoxO3在骨骼中也有表达,在成骨细胞中发挥重要作用。据报道FoxO功能丧失或增强可显著改变骨细胞功能和细胞间信号传导,其功能障碍可导致骨质疏松症或其他骨骼疾病[32]。FoxO对成骨细胞和破骨细胞均有影响,在成骨细胞中,FoxO可与骨钙素基因启动子结合,抑制骨钙素的表达,并与RUNX2结合,抑制其活性,从而使骨细胞数量减少。在破骨细胞中,FoxO通过磷酸化引起转录激活,直接促进破骨细胞的凋亡。FoxO也可通过成骨细胞间接影响破骨细胞,表现在FoxO可抑制Wnt信号传导,同时增加成骨细胞系中骨保护素表达,阻断RANK与RANKL之间的相互作用,减少破骨细胞的分化与成熟[33]。Iyer等[34]研究表明在I型糖尿病小鼠模型中,敲除成骨细胞、祖细胞中的FoxO1、3和4,可减轻松质骨的强度下降。Teixeira等[35]也发现在成骨刺激剂的影响下,小鼠间充质细胞FoxO1表达和活性均有所增加,进而刺激成骨标志物如RUNX2、碱性磷酸酶和骨钙素的表达,促进间充质细胞向成骨细胞分化。
Nrf2是重要的抗氧化转录因子,可激活并调控下游抗氧化蛋白解毒酶,是治疗多种疾病的潜在靶点[36]。研究表明,Nrf2作为一种抗氧化应激因子,在骨发育代谢中也有重要作用,主要抑制成骨细胞中RUNX2的转录活性,负性调节RANKL诱导的破骨细胞生成[37]。Pan等[38]发现服用阿齐沙坦可抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/NF-κB信号通路,改善卵巢切除(OVX)引起的骨质疏松症,并降低体内活性氧水平,抑制氧化应激。Nrf2沉默可逆转阿齐沙坦对MAPK/NF-κB信号通路的抑制作用,这可能成为治疗破骨细胞过度激活引起骨质疏松症的新靶点。
活化蛋白1(activator protein 1,AP-1)是骨骼发育中的重要调节因子,对于成骨细胞稳态至关重要,TGF-β、甲状旁腺激素和1, 25二羟基维生素D均可诱导激活AP1[39]。AP-1主要由Jun蛋白家族、Fos蛋白家族、转录激活因子(activating transcription factor,ATF)及J结构域蛋白(J domain-containing protein,JDP)亚家族组成, 亚家族单体以同源或异源二聚体的形式结合DNA靶序列,参与靶基因调节。在骨形成方面,AP1中的Fosb优先与Runx2启动子中的成骨细胞特异性增强子Ce1结合,促进成骨细胞的分化与形成,但Fosb短异构体ΔFosb则会导致骨硬化的发生[40]。同样,Fos样抗原1(FOSL1),也称为Fos相关抗原1(FRA1)的过表达也会加速成骨祖细胞向成骨细胞的分化,从而导致骨硬化[41]。
Sox9是SRY(雄性性别决定基因)相关基因家族中的转录因子,也是骨祖细胞形成的重要标志,对骨细胞形成起到至关重要的作用。Kuwahara等[42]研究发现Sox9阳性祖细胞可协调小鼠肋骨的大规模再生,促进骨修复。Julian[43]也发现Sox9可促进肥大软骨细胞中成骨细胞相关基因的表达,并促进这些细胞随后转分化为成骨细胞。人体SOX9基因突变会导致患者个体天生具有骨骼缺陷,如小下颌/小颌畸形、侏儒症和其他骨骼畸形。通常,整个成年期Sox9的表达可持续维持软骨和骨骼的发育[43]。
骨凝集素(osteolectin)可逆转骨质疏松症相关的骨丢失,可作为成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)的内源性抑制剂促进骨矿化。研究证实osteolectin阳性细胞是一种具有成骨功能的成骨祖细胞,可促进骨髓中的干细胞形成新骨[44]。研究人员用切除卵巢的小鼠模拟绝经后妇女骨质疏松症,经osteolectin治疗的小鼠骨量显著增加[45]。岳锐等[46]利用体外表达的小鼠osteolectin进行免疫沉淀发现其互作蛋白FAP,研究发现FAP对幼鼠骨骼发育无影响,但FAP缺失可显著改善小鼠衰老过程中四肢松质骨体积减少的症状,使小鼠的松质骨矿物质沉积率和骨形成率显著增加,成骨细胞也呈增加趋势,破骨细胞则显著减少[46]。抑制FAP活性可促进骨生成并抑制骨吸收,因此其有望成为治疗骨质疏松症的新型潜在药物靶标。
破骨细胞是由骨髓中的髓系祖细胞分化而成的单核巨噬细胞相互融合形成的多核巨细胞,其主要功能是骨吸收。破骨细胞起源于造血细胞,可被巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和RANKL激活,M-CSF主要促进破骨细胞前体的增殖,而RANKL则促进破骨细胞前体向成熟破骨细胞的分化。
OPG是一种分泌型糖蛋白,其主要作用是抑制破骨细胞的形成和骨吸收[47-48]。RANKL又叫骨保护蛋白配体,是一种II型跨膜蛋白,由成骨细胞和其他基质细胞产生[49]。NF-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)是RANKL的唯一受体,RANK与RANKL结合后可促进破骨细胞生成,发挥破骨作用[50]。
OPG/RANKL/RANK系统共同构成了对破骨细胞分化、活化与凋亡的调节关系,表现在RANK和OPG竞争性与RANKL结合,调控破骨细胞生理过程。当刺激骨吸收的因子作用于成骨细胞时,会诱导RANKL的表达,RANK作为RANKL的唯一受体与其结合,经过一系列级联反应促使破骨细胞分化成熟。而OPG为RANK/RANKL的诱饵受体,可竞争性地与RANKL结合,从而抑制RANK受体与RANKL配体的结合,进而抑制破骨细胞的分化,最终诱导破骨细胞凋亡。Ozaki等[51]的研究也证实了这一结论。在OPG基因敲除小鼠模型中,RANKL阻滞剂WP9QY(W9)肽通过抑制RANK与RANKL的结合,抑制破骨细胞生成,同时增强Wnt/β-catenin信号传导,增加成骨细胞生成,恢复牙槽中丢失的骨量。
组织蛋白酶K(cathepsin K)属于木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶家族,在破骨细胞中高度表达。当破骨细胞被激活时,驻留在破骨细胞溶酶体中的组织蛋白酶K被释放到再吸收腔隙中,引发骨再吸收。骨骼中含30 %矿化有机基质,有机成分主要由I型胶原组成,I型胶原能抵抗基质金属肽酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9)和丝氨酸蛋白酶等蛋白酶的水解,而组织蛋白酶K能有效分解胶原和任何羧基端肽,形成胶原单体,因此是骨吸收的重要标志物和理想的治疗靶点[52]。研究发现当组织蛋白酶K被抑制时,破骨细胞的骨吸收活性也被抑制,导致骨密度增加[53]。常用的组织蛋白酶K抑制剂包括Balicatib、Odanacatib和2H-吡喃-4-丙酸,与其他骨吸收抑制剂不同,它们抑制破骨细胞的活性,而非减少数量[54]。
骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种多功能、分泌型糖蛋白,是介导骨组织细胞与骨基质间的桥接,广泛参与骨相关疾病及骨质重塑过程,具有多种生物学活性。OPN可调节骨髓间充质干细胞、破骨细胞和成骨细胞的黏附、增殖和迁移,促进骨代谢和体内平衡,与各种骨疾病的发生和发展密切相关,如骨肉瘤、类风湿性关节炎和骨质疏松[55]。OPN通过影响体内白介素10(IL-10)、IL-12、IL-3、干扰素γ(IFN-γ)、整合素αvβ3、NFκB、巨噬细胞和T细胞的分泌水平发挥作用,并影响硫酸乙酰肝素蛋白受体(CD44)[56]。对破骨细胞的作用方面,OPN主要通过刺激CD44和αvβ3介导的细胞信号传导促进破骨细胞生成,并促进足小体的形成、破骨细胞存活和破骨细胞运动[57]。
M-CSF及其受体CSF-1R(又称为c-FMS)对破骨细胞发挥重要作用,M-CSF缺陷和c-FMS缺陷小鼠都患有骨骼生长迟缓和骨质疏松症[58]。c-FMS需要与αvβ3整合素协同以驱动破骨细胞功能,整合素β3基因敲除小鼠由于破骨细胞的功能缺陷导致骨量增加。重要的是, c-FMS和αvβ3整合素除了在破骨细胞活性中的独特作用外,这两个因子在骨吸收中也发挥协同作用[59],也可刺激破骨细胞骨架调节所必需的C-末端Src蛋白(c-Src),调节细胞骨架重排[60]。Zur等[61]使用双特异性抑制剂同时靶向c-FMS和αvβ3整合素,协同破骨细胞促进骨吸收,为治疗骨质疏松症和其他骨疾病提供了新的方向。
蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β/T细胞核因子1蛋白(Akt/GSK-3β/NFATc1)信号通路在细胞骨架分布、细胞迁移、细胞存活和细胞分化中起到积极调控作用。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在细胞存活和凋亡中起重要作用,Akt可促进GSK-3β/NFATc1的表达以诱导破骨细胞分化。研究发现RANKL诱导破骨细胞生成过程中,依赖于PI3K/Akt信号通路对NFATc1的调控。过度表达的Akt增加了非活性形式GSK-3β和NFATc1的形成,但过表达活性形式的GSK-3β能下调NFATc1的表达,减少破骨细胞的形成[62]。
雌激素和雄激素分别通过雌激素受体(estrogen receptor,ER)α,β及雄激素受体(androgen receptor,AR)发挥骨保护作用[63],人体中性激素分泌失衡会导致骨质疏松症。雌激素是男性和女性骨代谢的关键调节因子,在骨衬细胞中靶向调节RANKL的表达以此控制骨转换[64]。雌激素影响骨细胞、破骨细胞和成骨细胞,具有抑制骨重塑、减少骨吸收和维持骨形成的作用。研究表明OVX大鼠模型中雌激素缺乏会增加皮质骨的孔隙度,减少骨体积分数和骨小梁数量,增强胫骨近端骨小梁分离,降低骨强度[65]。促炎细胞因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、M-CSF和前列腺素E2(PGE2)能增加骨髓中破骨细胞前体的数量导致骨吸收增加,雌激素会降低这些因子表达水平并抑制过度骨吸收造成的骨质疏松。研究表明AR是雄激素抑制破骨细胞生成的关键因子,AR缺陷型雄性小鼠血清睾酮水平降低导致松质骨体积、骨小梁和皮质骨量减少,骨转换和骨吸收增强,而上调AR缺陷小鼠成骨细胞中AR的水平可促进RANKL的表达,进而促进破骨细胞生成[66]。雌性小鼠的AR缺失并不影响骨丢失,且AR缺失雌性小鼠的破骨细胞表面或骨微结构未受影响,表明破骨细胞的作用并不依赖AR[67]。骨生物学信号与生殖信号之间的关系不仅限于雌激素和雄激素,还包括kisspeptin、促性腺激素释放激素、促卵泡激素、黄体生成激素、催乳素、孕酮、抑制素、激活素和松弛素等[68]。目前亟需在基础和临床研究上取得有关生殖激素在骨生理学中作用的突破性进展,为骨质疏松症的治疗提供新的方向。
成骨细胞、骨细胞和破骨细胞分泌的细胞因子激动或抑制其他细胞,调节骨重塑进程,维持骨内稳态。这些细胞因子影响骨形成或骨吸收,或两者兼有。其水平的异常抑制或促进骨形成或吸收,可能导致骨骼疾病,包括骨质疏松症。深入了解骨细胞功能背后的分子机制有助于理解骨质疏松症的生物学机制,从而开发针对不同病因的治疗方法。目前针对患者骨质疏松症的靶向药物多用于减少骨吸收或增加骨形成,如抗吸收双膦酸盐(bisphosphonate,BP)类药物、雌激素、选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator,SERM)、denosumab和odanacatib;以破骨细胞为靶点,旨在改善骨形成的代谢类药物:甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)和PTH相关肽(PTHrP)。由于骨质疏松症在人与人之间存在病理生理差异,药物治疗可能会产生不必要的副作用。目前研究发现不同非编码RNA,如micro、lnc和circ RNA,在调节骨细胞存活、增殖、分化和凋亡方面起着重要的作用,可作为改善骨健康的新靶点。外泌体在骨质疏松症发生发展中也起着关键作用,多有报道,然而体内靶向给药仍是基因治疗学中一个具有挑战性的课题,需进一步研究。