循环血浆外泌体及其应用研究进展

陈倩 唐秋萍

海南省血液中心临床输血研究室（海口 570311）

外泌体（exosomes）是由细胞分泌的磷脂双分子层胞外囊泡样小体，直径30～150 nm，呈典型杯状结构。外泌体于1983 年PAN 和JOHNSTONE 观察绵羊网织红细胞的体外成熟过程时首次被发现，并在1987年被JOHNSTONE所命名［1-2］。其组成成分复杂，据ExoCarta 外泌体数据库统计，至今已发现的外泌体中包含9 769 种蛋白质、3 408 种mRNA、2 838 种miRNA 和1 116 种脂质［3］。外泌体广泛存在于血浆、尿液、唾液、脑脊液以及腹水等体液中。包括血细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞等在内的几乎人体所有活细胞均可分泌外泌体［4］。由于外泌体可通过自分泌、旁分泌方式作用于临近细胞，或通过血液循环长距离运输至远端细胞，介导细胞间通讯与遗传信息传递，因而在机体正常生理功能及疾病发生转归方面有着重要的作用［5］。来源于循环血浆的外泌体因易于取样、侵入性小、成本效益高且便于开展实时检测等优点，非常适合作为不同疾病诊断预后的生物标志物和靶向药物输送载体并用于临床治疗，故而成为近年来外泌体研究中的热点研究对象。本文主要就循环血浆外泌体在相关疾病研究和临床应用等方面的进展作一阐述。

1 循环血浆外泌体与疾病

外泌体最初被认为是一种清除细胞代谢废物的运输工具，但越来越多的研究已证明，包括循环血浆外泌体在内的来源于多种体液的外泌体具有重要的生物学功能，在不少疾病的发生、发展和治疗中都发挥着重要作用。

1.1 心血管疾病实验证明，循环血浆外泌体既可通过影响多种信号通路介导心血管疾病的病理性损伤过程，同时来自健康供者血浆外泌体中的脂质、蛋白质、核酸等特异性分子也可通过促进细胞增殖分化和存活、加速血管生成、减少凋亡以及抑制纤维化等机制发挥对心脏的保护作用［6-7］。在对慢性心血管疾病充血性心衰发病机制的研究中就发现，来自健康供者循环血浆的外泌体能够利用miR-126 靶向转录调节外周血单核细胞中多种关键细胞因子的产生和旁分泌过程，从而影响基因的转录活性和细胞粘附分子、促炎性蛋白的表达，参与调控单核细胞-内皮细胞的相互作用以及慢性心衰的发病过程，因而可作为充血性心衰的潜在治疗工具［8］。对急性心肌梗死患者的研究也证明，来自健康供者血浆外泌体的miR-342-3p 可分别通过靶向性别决定区Y 框6 基因（sex determining region Y box 6，SOX6）介导的凋亡和转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）介导的自噬来减轻心肌细胞损伤，从而参与外泌体介导的心脏修复［9］。

1.2 神经退行性疾病由于外泌体及其组成成分参与了神经系统包括神经保护与修复、神经炎症、突触可塑性和病理分子的扩散传播等多种生理和病理过程，因此它们被认为是研究神经退行性疾病的发病机制、诊断和预测疾病进展的理想对象［10］。细胞外毒性β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积形成神经炎性斑和细胞内过度磷酸化的tau 蛋白形成神经元纤维缠结是阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD）的主要病理特征。最近的研究表明，外泌体中也含有Aß 和tau 蛋白。外泌体不仅可以介导Aβ 寡聚体（Aβ oligomers，oAβ）在神经元之间的传播，也可介导病理性tau蛋白的扩散，从而促进疾病进展。通过阻断外泌体的形成、分泌或摄取，可以减少Aβ 寡聚体和tau蛋白的扩散及相关的毒性，表明外泌体在阿尔茨海默病的发病过程中起着重要作用［11-12］。对比阿尔茨海默病患者和健康对照者循环血浆外泌体的蛋白质表达发现，β-淀粉样蛋白42、总tau 蛋白（Ttau）和磷酸化tau 蛋白（P-tau）181 等多种蛋白成分存在差异表达。此外，阿尔茨海默病患者血浆外泌体Aβ1-42 和P-S396-tau 表达水平要显著高于匹配的健康对照者，而且外泌体的体积相对较小，数量也较低，这些都有助于区分阿尔茨海默病患者与健康个体［10，13］。因此从循环血浆大量的外泌体中寻找发生变化的蛋白质，对于进一步了解神经退行性疾病的发生和进展机制，协助疾病诊断具有重要意义。

1.3 内分泌疾病1 型糖尿病（type 1 diabetes mel‑litus，T1DM）是由于自身反应性T 细胞攻击胰岛β 细胞引起的慢性免疫性疾病。虽然关于T1DM发病机制尚不完全清除，但有研究认为，胰岛β 细胞与免疫细胞，特别是与T 淋巴细胞之间的异常相互作用，是主要致病机制之一［14］。越来越多的证据显示，外泌体可能是β细胞和免疫细胞之间的新型介质，并通过多种机制参与了T1DM 的进展。T 淋巴细胞释放的外泌体可通过外泌体miRNA 介导的信号通路诱导β 细胞凋亡，而胰岛来源的外泌体含有β 细胞自身抗原，可以被抗原提呈细胞吸收并激活，从而启动自身免疫反应［15-16］。最近有研究团队分析了与 T1DM 进展相关的循环血浆外泌体中circRNA、lncRNA 和mRNA 的表达谱，同时构建了circRNA-miRNA-mRNA 相互作用网络，通过揭示各种基因及其上游元件在T1DM 进展中的调控机制，为更好的理解外泌体在T1DM 发病中的潜在作用提供了新的实验基础［17-19］。

1.4 血液系统疾病外泌体可在参与机体正常造血的同时，也在恶性血液病的发生和发展过程中起着干扰正常造血的作用。研究表明，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）来源的外泌体不仅可通过诱导骨髓基质基因的表达改变，使支持正常造血和成骨的相关基因表达下调，从而抑制骨髓的正常造血，也可通过抑制正常造血干细胞的功能来影响造血［20-21］。此外，来自患者循环血浆的外泌体还可将骨髓生态位改造成有利于白血病细胞生长且抑制正常造血的微环境［22］。而循环血浆外泌体中的二肽基肽酶4（dipeptidyl‑peptidase 4，DPP4/CD26），是一种具有造血调节功能的丝氨酸蛋白酶，它可在体外抑制正常人造血祖细胞的分化，干扰造血功能。实验证明通过药理学抑制该病患者血浆外泌体二肽基肽酶4 的活性可以逆转外泌体介导的骨髓抑制作用［23］。这些研究结果提示阻断外泌体对造血功能的负面调控可能是急性髓系白血病和其他白血病的一种新的治疗方法。

1.5 其他疾病研究显示，血浆外泌体作为重要的生物介质，不仅参与了调节和维持如类风湿性关节炎、原发性免疫性血小板减少症等自身免疫性疾病的发生与进展［24-25］，在对全身感染性疾病脓毒症的研究中也证明，循环血浆外泌体对脓毒症患者的免疫系统也具有潜在调节作用，参加了脓毒症的多种病理过程，且血浆外泌体水平与器官衰竭的严重程度以及脓毒症危重患者的死亡率预测均相关［26-27］。

2 循环血浆外泌体的临床应用

最近几年的研究中，外泌体的临床应用逐渐成为一个主要的探索领域。循环血浆外泌体在肿瘤的诊断和治疗、靶向药物载体的构建和免疫治疗药物的开发上，均表现出了良好的研究和应用前景［28］。

2.1 肿瘤诊断标志物外泌体在不同类型肿瘤诊断方面的巨大潜力已经获得了广泛的认识，以外泌体作为生物标志物在肿瘤临床诊断中表现出多种优势：首先外泌体表达其来源的宿主细胞的特异性表面标记物，因而可识别其来源；其次外泌体由脂质双分子层封闭包裹，在保护其所携带的生物活性物质不被胞外蛋白酶所降解的同时，保证了内含物的稳定性和完整性；并且外泌体内含物的含量和释放都受到严格的生理和病理状况调控，可反映身体的生物状态，提供活细胞的实时信号［29］。除以上优势外，血浆作为临床常规检测样本，可通过无创或微创途径方便获取，简便易行、可重复操作、不易感染且成本低，因而相较于其他来源的外泌体，循环血浆外泌体更加适合用于肿瘤早期诊断、监测和预后评估。

已有越来越多的证据表明循环血浆中的外泌体参与了多种肿瘤的发生发展过程，可为肿瘤的早期诊断提供重要信息。在肝细胞癌（hepatocel‑lular carcinoma，HCC）的研究中发现，血浆外泌体中长链非编码RNA RP11-85G21.1（lnc85）的表达水平在肝细胞癌患者中显著升高，对肝细胞癌的诊断具有重要意义［30］。对肺腺癌（lung adenocarci‑noma，LUAD）的研究则显示，肺腺癌患者血浆外泌体中趋化因子配体7（C-X-C chemokine ligand 7，CXCL7）mRNA 和蛋白表达均明显增加，提示血浆外泌体CLCL7 可成为肺腺癌早期诊断的有效生物标志物［31］，而血浆外泌体miR-221 则认为对非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）表现出较好的辅助诊断价值［32］。此外，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）患者中，血浆外泌体miRNA-23b 的低表达被证明与与多个不良临床病理学因素及较短的总生存期密切相关，并有助于结直肠癌的预后评估［33］。由于与传统的生物标志物相比，外泌体表现出更高的诊断灵敏度、准确性和可靠性，因而可作为肿瘤早期辅助诊断的一种新型理想生物标记物。

2.2 肿瘤免疫治疗随着研究认识到外泌体作为细胞间通讯的关键信使，可参与肿瘤和免疫细胞间的信号传导和免疫调控，外泌体在肿瘤免疫治疗中的作用引起广泛关注。研究表明，肿瘤患者血浆外泌体可向免疫细胞递送抑制性货物，诱导免疫抑制，降低免疫细胞的的抗肿瘤活性。对头颈部肿瘤患者的研究发现，患者血浆外泌体携带免疫抑制分子，可通过诱导CD8+T 细胞凋亡，抑制CD4+T 细胞增殖，抑制NK 细胞细胞毒性来干扰免疫细胞的功能，抑制抗肿瘤的免疫反应［34］。而对B 细胞的研究同样显示，血浆外泌体在体外对B 细胞的增殖、存活和功能也具有生理性抑制作用［35］。HONG 等［36］发现患有晚期恶性肿瘤的患者血浆中的外泌体可以干扰免疫治疗，对急性髓系白血病患者接受NK-92 细胞过继性免疫治疗的研究显示，来自患者血浆的外泌体除携带白血病相关抗原外，还含有细胞程序性死亡配体1（programmed death-1 ligand，PD-L1）等多种免疫抑制分子，在体外可抑制NK-92 细胞的细胞毒性、分化、增殖和定向迁移等多种功能，并对NK-92 细胞进行重新编程，从而干扰活化免疫细胞的抗白血病活性，并可能限制过继细胞疗法的预期治疗效果 。

肿瘤患者血浆中外泌体是肿瘤细胞来源的外泌体（tumor-derived exosomes，TEX）和非肿瘤细胞来源的外泌体的混合物，后者主要是免疫细胞来源的外泌体（immune cell-derived exosomes，IEX）。因此，对肿瘤患者血浆外泌体的检测，可以部分反映肿瘤状态和机体的免疫功能。比如，肿瘤患者血浆中外泌体的数量和外泌体表面免疫调节蛋白PD-L1 的水平，被认为与疾病的活动性、肿瘤分期和预后具有相关性，患者血浆外泌体中PD-L1 水平越高，疾病活动性越强且分期更晚。此外，PDL1+外泌体可剂量依赖性抑制T 细胞活性，血浆外泌体PD-L1 含量越高，其抑制CD8+效应T 细胞活化的能力就越强［37］。最近THEODORAKI 等［38］的研究结果显示，肿瘤患者接受化疗治疗和随访期间，总外泌体蛋白水平，肿瘤/免疫细胞来源外泌体的比例以及外泌体的免疫抑制活性均会发生显著变化，表明通过检测循环血浆外泌体可以准确反映肿瘤患者的整体免疫状态以及治疗过程中免疫反应的变化。因而血浆外泌体有望作为一种潜在的非侵入性生物标记物，代替免疫细胞，用于患者对肿瘤治疗反应的监测以及预后疗效的评价。

2.3 靶向药物输送载体外泌体可将宿主细胞本身所包含的多种生物活性分子从供体细胞转移到受体细胞，并影响后者的生物学特性，所以天然的成为一种富有吸引力的药物输送载体。不同于之前的脂质体或聚合物纳米颗粒等合成纳米药物载体，外泌体作为一种高效纳米级药物输送系统，具有许多独特的优点：如出色的生物相容性、高度的代谢稳定性、低免疫原性、低毒性、主动靶向性和特异性以及良好的生物膜渗透能力［29］。目前通过运用细胞转染、声波降解、电穿孔、冻融循环、表面活性剂处理和透析等多种物理、化学以及生物技术，可将治疗药物装载到外泌体中并封存，进而实现不同的治疗效果，同时发挥药物的最佳有效性［39］。血液特别是血浆，是外泌体的丰富来源，非常适合治疗中的应用。神经退行性疾病的治疗过程中，血脑屏障的存在往往阻碍了大多数药物的通过。研究发现，未经修饰的血液外泌体对大脑具有良好的天然靶向能力。通过饱和溶液培养法，可将治疗药物多巴胺有效装载到血液外泌体中，并成功输送到包括纹状体和黑质在内的大脑区域，在帕金森病（Parkinson′s disease，PD）小鼠模型中已显示出良好的治疗效果［40］。在对另一神经退行性疾病阿尔茨海默病的治疗中发现，装载治疗药物懈皮素（quercetin，Que） 的血浆外泌体，可增强懈皮素的脑靶向性，显著提高药物的生物利用率［41］。表明血液尤其是循环血浆外泌体可作为未来富有前景的疾病靶向治疗药物输送平台。

2.4 恢复期血浆外泌体免疫治疗过去20 年间，人们曾在包括流感、严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和中东呼吸综合征（middle east respiratory syndrome，MERS）等在内的历次病毒爆发中都成功使用了恢复期血浆治疗这一方法［42］。新型冠状病毒感染（coronavirus dis‑ease 2019，COVID-19）疫情期间，对于部分严重感染者，这种被动免疫疗法再次发挥了重要作用。然而该疗法中，供者的血浆会存在广泛的抗体效价变异，且伴随传播传染性病原体的风险，此外对于危重患者可能增加炎症和血栓级联反应，罕见情况下，还可能导致输血相关急性肺损伤。因此更多的研究围绕恢复期血浆的衍生产品而展开，其中恢复期血浆外泌体被认为对COVID-19 重症感染者的治疗具有重要意义［43］。在对恢复期血浆外泌体免疫机制及生物活性的研究中发现，血浆中源于活化的免疫调节细胞如Th1 细胞、CD8+细胞毒性 T 细胞以及NK 细胞等分泌的外泌体，可能在恢复期血浆的治疗中发挥了有效的免疫功能。这些外泌体大多能以足够的敏感性和特异性识别抗原，并触发细胞的免疫调节反应。同时外泌体在细胞间转移包括tRNA、rRNA、mRNA 和miRNA 等在内的RNA，也会在表观遗传学上影响受体对病毒的反应［44-45］。基于以上发现，研究者们最近利用COVID-19 感染患者恢复期免疫血浆源性外泌体开发了新型治疗剂ChipEXO™。该制剂在体外试验中显示出强大的抗病毒特性，并具有促进组织保护和免疫调节功能［46］。在随后进行的单中心前瞻性、开放标签、单臂介入研究中，ChipEXO™ 作为雾化吸入物用于治疗因呼吸衰竭而入住ICU 的重症COVID-19 患者，也显示出了良好的安全性和有效性，未来有望成为治疗COVID-19 介导肺损伤的一种新型治疗策略［47］。

3 展望

外泌体作为一个崭新的、迅速扩展的研究热点，近年来受到了国内外研究者们的广泛关注，围绕外泌体的结构和生物学功能研究取得了相当成功，外泌体分离提取技术已极大优化，临床应用研发进程也在被快速推进。然而外泌体尤其是循环血浆外泌体的基础和应用研究仍面临不少瓶颈问题，比如如何更有效的获得高产量和高纯度的循环血浆外泌体，如何明确循环血浆外泌体与其他组织和器官相互作用的具体机制，以及如何更好的增强循环血浆外泌体作为药物输送载体的负载能力和靶向性。相信随着外泌体研究工作的深入，通过开展更广泛的多学科研究，克服现有生物技术的局限性，将能更好的提高外泌体在临床诊断和治疗中的应用潜力。