基于Cu,Fe-N-C氧化酶活性构建邻苯二甲酸酯荧光检测探针

李 宏，史 巧，陈骏飞，王馨蕊，汤回花，李秋兰，杨德志，杨亚玲,*

（1.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南 昆明 650221；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一个化合物系列，主要用于生产柔性聚氯乙烯或乙烯基产品，是最常用的塑化剂之一。PAEs与塑料主体以分子间相互作用力的形式结合，较易转移到各种环境中，对空气、土壤、水源甚至食品造成污染[1-3]。PAEs是一种环境激素类物质，可在生物体内富集而产生毒性作用，引起肝脏、免疫、生殖内分泌和胚胎发育毒性等，严重威胁人们的身体健康[4-6]。我国在2016年发布了关于PAEs的食品国家标准，对食品中PAEs含量限制范围作出明确规定[7-8]。目前，PAEs检测主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱-质谱联用技术、近红外光谱分析技术、荧光光谱法以及实时荧光定量聚合酶链式反应技术等[9-15]。荧光光谱法具有检测便捷、灵敏度高、重现性好、强选择性等优势[16]，但由于PAEs分子本身不能发出荧光[17-18]，各种PAEs的荧光检测主要集中在对PAEs进行衍生，通过间接荧光法检测PAEs[19-20]。

自2007年我国科学家阎锡蕴发现四氧化三铁磁性纳米颗粒本身具有类过氧化物酶的催化活性以来[21]，纳米酶的研究得到快速发展，由于其稳定性高、易于生产及成本低，可作为天然酶的替代品等优势，成为研究热点[22-23]。其中单原子纳米酶由于与天然金属酶的M-Nx位点相似，表现出优异的催化活性及选择性，受到广泛关注[24]，在单原子纳米酶中引入第2个过渡金属原子，可以改善酶活性，提高对底催化的选择性[25-27]。本研究利用热解法合成了铜、铁双原子纳米酶（Cu,Fe-N-C），基于PAEs调节Cu,Fe-N-C氧化物模拟酶活性，建立荧光检测新方法。如图1所示，Cu,Fe-N-C能催化邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）生成黄色荧光产物2,3-二氨基吩嗪（2,3-diaminophenazine，DAP）。而PAEs的加入会增强催化体系的荧光强度，由此建立痕量PAEs的荧光探针检测方法。邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二辛酯（dioctyl phthalate，DOP）、邻苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DINP）5 种PAEs类物质有此现象，该方法检测这5 种PAEs的总量。

图1 PAEs检测示意图Fig.1 Schematic diagram of PAE detection

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱腌菜样品，购自云南昆明市呈贡区超市。

DMP、DEP、DBP、DOP、DINP、（分析纯，纯度≥99%） 中国医药集团上海化学试剂公司；氯化铜（CuCl2）、氯化铁（FeCl3）、中-四(4-羧基苯基)卟吩、甲醇、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）、OPD、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

GS800A分子荧光光谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；UV-2600紫外-可见分光光度计 岛津（上海）实验器材有限公司；Tecnai G2 TF30场发射透射电子显微镜 荷兰FEI公司；X射线衍射仪、TENsoR27型傅里叶红外光谱分析仪 德国Bruker公司；XW-800快速混匀器 上海汗诺仪器有限公司；HC-3018R型高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；高温管式炉 上海贝克有限公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；pH S-3 B精密酸度计赛多利斯（上海）贸易有限公司；78-1型磁力加热搅拌器 上海南汇电讯器材厂；AB204-S电子分析天平 梅特勒-托利多科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Cu,Fe-N-C材料的制备

参照Lin Zhen[28]和Huang Xuemin[29]等的研究进行改进。对配体分子的筛选，材料制备方法如下：10 mL甲醇中含有2.636 g CuCl2作为溶液A，20 mL甲醇中含有5 g中-四(4-羧基苯基)卟吩和2.376 g FeCl3（按Cu、Fe物质的量比1∶1计算得到）作为溶液B，将A和B两种溶液均匀混合并80 ℃烘箱干燥老化2 h。得到的墨绿色干燥粉末称取5 g于石英舟中，管式炉750 ℃在N2保护下煅烧2 h得到黑色粉末。粉末于硫酸溶液（H2SO4∶H2O=1∶9，V/V）中12 h浸泡后用水反复冲洗。干燥后，后续用实验用水配制成质量浓度为0.5 mg/mL的悬浮液使用。

1.3.2 PAEs的检测

以DMP为PAEs的模式物，在EP管中依次加入100 μL Cu,Fe-N-C和50 μL 100 mmol/L OPD，一定质量浓度的DMP标准溶液，2 mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，室温孵育10 min后，于8000 r/min离心3 min，取上层清液在421 nm激发波长下，564 nm发射波长处测定荧光强度。设定ΔI=I-I0，I表示加入DMP后溶液的荧光强度；I0表示未加入DMP作空白时溶液的荧光强度。

1.3.3 Cu,Fe-N-C材料酶活性的测定

采用TMB及ABTS显色反应测定Cu,Fe-N-C纳米酶的活性。首先，将100 μL Cu,Fe-N-C、100 mmol/L的TMB及ABTS各50 µL，加入到2 mL pH 4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混匀，室温孵育10 min后，于8000 r/min离心3 min，取上层清液用紫外-可见分光光度计在652 nm及415 nm波长处测定吸光度，每个样品测定2～3 次，取平均值。

Cu,Fe-N-C氧化物模拟酶的酶活性动力学研究，在100 μL Cu,Fe-N-C（0.5 mg/mL）和2 mL 8.0磷酸盐缓冲溶液中，加入不同浓度的OPD。充分混匀，室温孵育10 min后，在564 nm发射波长处测定荧光强度。典型的米氏方程模型：

式中：V为反应速率；Km为米氏常数；Vmax为最大反应速率；[S]为底物OPD浓度。

1.3.4 食品中PAEs的测定

称取经粉碎混匀的样品10.00 g于玻璃锥形瓶中，加入50 mL正己烷，于50 ℃水浴温度下，超声提取30 min，过滤不溶物，取滤液经旋转蒸发仪浓缩，水浴70 ℃浓缩至溶液体积在1 mL以下，用乙腈定容至5 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得样品测定液。

1.4 数据处理

除反应式用Chemdraw Professional 16.0处理外，所有图片均用Origin 2019b进行加工处理。三线表利用Microsoft Office Word 2019绘制。

检测标准曲线采用线性回归分析方法，以R2评估方法准确度。此外在样本中进行加标，取6 次测定值计算加标回收率验证方法的准确度和精密度。

2 结果与分析

2.1 Cu,Fe-N-C模拟酶的表征

从Cu,Fe-N-C的透射电子显微镜图（图2a）可以看出，所制备的Cu,Fe-N-C呈现类球形，分散性较好，且尺寸大概在3～5 nm范围内，此外，高分辨透射电子显微镜图像显示了0.42 nm的晶面间距（图2b），对应石墨碳的（002）面（图2b）[30]。图2c为EDS元素分布图，图像显示C、N、O、Fe和Cu均匀分布于Cu,Fe-N-C纳米材料中。

从图2d～g可以看到5 个不同的特征峰，分别为C1s、N1s、O1s、Cu2p和Fe2p，表明该材料存在C、N、O、Cu和Fe元素；与Fe-N-C及Cu-N-C相比，Cu,Fe-N-C的Fe2p及Cu2p峰向更高的结合能方向移动，这归因于Fe及Cu与碳材料之间的电子离域[30]，电子离域也改变了金属的电子结构，使Fe和Cu物种均匀分布；N1s谱分解为位于（398±0.4）、（399.4±0.4）、（400.8±0.4）eV和（402.0±0.4）eV的4 个峰，分别归属于吡啶N、FeN、吡咯N和石墨N的峰。在N1s的精细X射线光电子能谱（图2g）中，Cu,Fe-N-C纳米酶的吡啶氮含量最高，石墨N及吡咯N含量相近，氧化N和Fe/Cu-N含量相近。

图2 Cu,Fe-N-C的透射电子显微镜（a）、高分辨透射电子显微镜（b）、EDS元素分布（c）和X射线光电子能谱（d～g）图Fig.2 TEM image (a),HRTEM image (b),elemental distribution map (c) and XPS spectrum (d-g) of Cu,Fe-N-C

2.2 Cu,Fe-N-C拟氧化酶活性

Cu,Fe-N-C拟氧化酶活性用典型的TMB、ABTS及OPD作底物，如图3所示。在没有H2O2存在的条件下，TMB和ABTS产物在波长652 nm及415 nm处有紫外特征吸收峰，同时呈现深蓝色、绿色（图3a）。而OPD的氧化产物在421 nm的光激发下，发射出峰位于564 nm的黄色荧光（图3b）。这些证据表明Cu,Fe-N-C具有模拟氧化酶活性。

图3 Cu,Fe-N-C催化TMB和ABTS的紫外吸收图（a）和OPD的发射谱图（b）Fig.3 UV-vis absorption spectra with substrates of ABTS and TMB (a) and fluorescence emission spectra with substrate of OPD (b) in the catalysis of Cu,Fe-N-C

为了更深入地了解Cu,Fe-N-C的拟氧化酶活性，以OPD为底物，分析其稳态动力学，记录不同OPD浓度和反应时间下的荧光强度，由Lineweaver-Burk方程（图4）得到了米氏常数Km和最大初始速率Vmax。Vmax指最大反应速率，即当酶的活性位点完全被底物占据时的反应速率；Km指反应速率达Vmax值一半时所需的底物浓度，表示酶对底物的亲和力，Km可以用来评价纳米酶的催化活性，反映了纳米酶对相应底物的亲和力[31-32]。虽然Cu,Fe-N-C没有表现出显著的Vmax（2.90×10-8mol/（L•s）），但其Km值（0.456 mmol/L）低于大多数已报道的模拟氧化酶，表明Cu,Fe-N-C对OPD具有很高的亲和力和模拟氧化酶的活性。

图4 OPD拟合米氏方程曲线（a）和OPD线性方程（b）Fig.4 Michaelis-Menten curve (a) and Lineweaver-Burk plot (b) for OPD

2.3 PAEs测定机制分析

为了验证研究体系中自由基的产生，研究分别使用Fe（II）-EDTA、异丙醇（isopropyl alcohol，IPA）和四甲基哌啶（tetramethylpiperidine，Tempol）分别为H2O2、羟自由基和超氧阴离子自由基的捕获剂。如图5a所示，IPA的加入，使得Cu,Fe-N-C/OPD体系荧光显著降低，而Fe（II）-EDTA和Tempol的加入相对而言变化较小，所以推断在Cu,Fe-N-C催化OPD氧化为DAP过程中羟自由基为主要的活性物。此外，在加入DAP到体系中之后，羟自由基含量明显增加。上述研究结果表明，在Cu,Fe-N-C/OPD体系中加入DMP可有效促进荧光DAP的生成。

PAEs 在碱性条件下水解为邻苯二甲酸，而在Cu,Fe-N-C/OPD体系中羟自由基的产生，会引起邻苯二甲酸羟基化产生羟基苯甲酸，羟基苯甲酸具有荧光，且其最大发射波长（440 nm）与DAP的激发波长（421 nm）相接近。故而推断其增敏机制可能是由于羟基苯甲酸和DAP之间的荧光共振能量转移，即DMP水解产物发射峰和DAP荧光激发峰的叠加（图5b、c）。

图5 自由基的捕获图（a）、DMP和DAP的荧光激发和发射（b）、反应机制（c）Fig.5 Fluorescence intensity versus wavelength plots showing free radical capture (a) and fluorescence excitation and emission of DMP and DAP (b),and reaction mechanism (c)

2.4 荧光探针测定PAEs的条件优化

2.4.1 溶液pH值对体系的影响

天然纳米酶在酸性环境下会表现出较强的催化活性。为获得荧光探针高灵敏测定PAEs的最优pH值，实验选用0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液作为缓冲体系，考察缓冲溶液pH值的影响。如图6a所示，缓冲溶液pH 6～9范围内，DMP对Cu,Fe-N-C氧化物模拟酶活性有明显增强作用，在pH 8.0时催化氧化OPD效果最佳。因此，研究选用pH 8.0磷酸盐缓冲溶液。

图6 溶液pH值（a）和反应温度（b）对Cu,Fe-N-C+OPD检测体系的影响Fig.6 Effect of reaction solution pH (a) and temperature (b) on Cu,Fe-N-C+OPD detection system

2.4.2 反应温度及时间的影响

如图6b所示，在室温（25 ℃）下，反应10 min，荧光强度即基本保持稳定。虽然后续温度升高，体系的荧光强度增强，但考虑到能耗问题，因此本实验选择室温（25 ℃）下反应10 min。

2.5 荧光探针测定PAEs

如图7a所示，当Cu,Fe-N-C与DMP同时加入OPD溶液时，体系的荧光强度进一步升高，在564 nm波长处，溶液的荧光强度随着DMP质量浓度增加而增加。如图7b所示，在优化后的实验条件下，绘制标准曲线，DMP质量浓度在1.25～50 μg/L范围内呈较好的线性关系，相关系数（R2）为0.9900，检出限（limit of detection，LOD）为0.76 μg/L。

图7 不同DMP质量浓度对体系荧光光谱（a）和DMP线性关系（b）图Fig.7 Fluorescence spectra of the system in the presence of different concentrations of DMP (a),and linear relationship between fluorescence intensity and DMP concentration (b)

2.6 荧光探针对PAEs测定的选择性

筛选16 种PAEs对荧光探针体系的影响，结果表明，有5 种PAEs对体系有响应，说明所构建的探针具有很强的抗干扰性，如图8a所示。同时，考察溶剂对探针体系的影响，结果表明，不同体积分数乙醇对Cu,Fe-N-C/OPD体系有轻微影响，但可忽略不计（图8b）。且N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）、正己烷（Hexane）、乙酸（acetic acid，HAc）、丙酮（propanone，PA）、三乙胺（triethylamine，TEA）、乙腈（acetonitrile，ACN）、苯胺（Aniline）等潜在干扰成分对探针体系的影响均可忽略不计，（实验中干扰成分质量浓度为DMP的50 倍），结果见图8c。

图8 PAEs对荧光探针体系的影响（a）、溶剂对探针体系的影响（b）和干扰成分对探针体系的影响（c）Fig.8 Influence of PAEs (a),solvents (b),and interfering substances (c) on the probe system

2.7 发酵食品中PAEs测定

按1.3.4节进行样品处理，检测3 种发酵食品、发酵食品熟料包装袋及加标后样品中PAEs含量。在最优条件下，所测得样品的结果见表1、2。结果表明，3 种发酵食品及发酵食品熟料包装袋样品中均检出PAEs，其中3 种发酵食品PAEs含量在0.16～0.53 μg/kg之间，3 种发酵食品熟料包装袋PAEs含量在2.25～3.74 μg/kg之间，样品的加标回收率在88.0%～104.6%范围内。该研究结果符合GB 5009.12—2017《食品中铅的测定》要求的精密度，本研究测定结果的相对标准偏差不高于3.1%，表明用本法测定发酵食品中DMP结果精密度高、稳定性好。

表1 小米辣、榨菜和酱腌菜样品中PAEs含量的测定（n=6）Table 1 Results of determination of PAE contents in real samples (n=6)

表2 小米辣、榨菜和酱腌菜等实际样品熟料包装袋中PAEs的检测（n=6）Table 2 Recoveries of added PAEs from pickle packaging bags (n =6)

3 结论

建立了一种基于Cu,Fe-N-C纳米酶氧化物模拟酶荧光探针检测发酵食品中PAEs新方法。研究先以热解法制备双原子Cu,Fe-N-C纳米材料，该纳米材料具有模拟酶氧化酶特性，催化氧化底物OPD，使生成有荧光的DAP。PAEs可以使Cu,Fe-N-C/OPD催化体系荧光线性增强。从而建立了DMP的检测方法，方法的LOD可达到0.76 μg/L，完全满足实际需求。结果表明，该反应体系对5 种PAEs有响应，研究以DMP为代表物。并且将建立方法用于发酵食品及发酵食品熟料包装袋中PAEs的测定，得到满意结果，表明方法对实际检测具有一定的应用意义和可行性。然而该方法不能实现对所有PAEs类物质进行检测。