常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株

凌思雨，王 洲，张会敏，李 闯，刘庆涛，刘 艳，薛正莲

（安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽省工业微生物分子育种工程实验室，微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽 芜湖 241000）

谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的非蛋白类三肽化合物[1]，广泛存在于大多数真核生物和某些原核生物中[2]。在生物体内具有还原型和氧化型两种形式[3]，其中还原型谷胱甘肽占大多数，约为90%[4-5]。由于其具有抗氧化性[6]、清除自由基[7]、解毒[8]、美白[9]等功能，谷胱甘肽被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业[3,10]。因此，近年来国内外对谷胱甘肽的需求呈现出一种上升趋势[11]。目前，酵母发酵法生产谷胱甘肽是工业生产上的主流，常用的生产菌种主要包括酿酒酵母[12-13]、产朊假丝酵母[14]和毕赤酵母[15]。

由于传统的菌种选育方法过程繁琐、效率低下[16]，由清华大学与天木生物科技有限公司合作研发的常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变技术可有效解决上述问题。ARTP诱变具有高突变率、操作简单、诱变速度快且对环境无污染等优点[17-18]，是一种新型诱变技术，已被广泛应用到各类微生物菌种筛选过程中[19]。同时，基于液滴微流控技术研发而成的一款全自动高通量微生物微液滴培养（microbial microdroplet culture system，MMC）系统具有高通量、微量化及自动培养和传代等功能[20-21]，为菌种诱变之后的复杂筛选工作提供了一种高效方法[22-23]。目前，将ARTP与MMC联合应用于菌种选育的相关研究还鲜见报道，因此具有一定的研究前景和理论价值。

为了获得高产谷胱甘肽的毕赤酵母菌株，以实验室保藏的1 株毕赤酵母BY-1作为出发菌株，首先通过ARTP诱变技术并结合梯度浓度1,2,4-三氮唑平板筛选方法，验证在高质量浓度1,2,4-三氮唑抗性平板上生长菌株的谷胱甘肽产量，明显高于低浓度1,2,4-三氮唑平板上生长的菌株。然后进一步以1,2,4-三氮唑作为筛选因子，利用MMC对经过诱变的菌株进行适应性进化，提高出发菌株对1,2,4-三氮唑耐受性的同时筛选出高产谷胱甘肽的毕赤酵母菌株。本实验旨在将ARTP诱变技术与MMC适应性进化联合应用于高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株的选育，相比传统的物理诱变、化学诱变和生物合成学手段相比，提供一种简便高效的育种方式，具有广泛的市场应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株，本实验室命名为BY-1。

1.1.2 培养基

菌种培养用液体和固体培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L；固体培养基中额外添加20 g/L琼脂粉。诱变菌株进行摇瓶培养所用液体培养基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，硫酸铵5 g/L，无水磷酸二氢钾5 g/L，七水硫酸镁5 g/L，氯化钠0.1 g/L，氯化钙0.1 g/L。培养基需115 ℃灭菌30 min后使用。

1.1.3 试剂

1,2,4-三氮唑、Tris-HCl缓冲液、2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoic acid，DTNB） 生工生物工程（上海）股份有限公司；40%乙醇溶液 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ARTP-IIS ARTP诱变育种仪 无锡源清天木生物科技有限公司；MMC-B2 MMC培养仪 洛阳华清天木生物科技有限公司；1510酶标仪 赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；D3024高速微量离心机 大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；ZQZY-78BN恒温培养摇床 上海知楚仪器有限公司；Mixer 4K微型旋涡混合仪 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 毕赤酵母ARTP诱变

1.3.1.1 BY-1菌株生长曲线制作及对数生长期的确定

将活化好的毕赤酵母菌（BY-1）转移至装液量为30 mL的250 mL摇瓶中，置于恒温培养摇床中30 ℃、220 r/min过夜培养。将BY-1菌悬液浓度稀释到OD600nm约1.0，转入MMC专用进样瓶，在MMC系统中创建液滴培养单元，并使用MMC系统自带的光密度检测装置检测液滴中BY-1菌株生长过程中OD600nm值的变化，用于制作生长曲线，以确定BY-1进入对数生长期的时间。

1.3.1.2 ARTP诱变致死率曲线的制作及最佳ARTP诱变处理时间的确定

取对数生长期的BY-1菌液，稀释菌液浓度到OD600nm约为0.6～0.8。取10 μL稀释好的菌液，将其均匀涂布在ARTP专用载片上，置于ARTP诱变育种仪中对BY-1菌株进行诱变处理[24]。ARTP诱变育种仪配备纯度超过99.99%的氦气；设置处理参数：入射功率120 W，气体流量10 L/min，照射距离2 mm。设置不同诱变处理时间：40、80、120、160、200 s和240 s，并计算不同处理时间的菌株致死率，以绘制ARTP诱变致死率曲线。菌株致死率的计算方法为：将处理结束的载片装入含有990 μL无菌生理盐水中，经微型旋涡混合仪充分振荡，以未经诱变处理过的菌液作为对照，稀释成不同梯度后均匀涂布于YPD固体培养基。而后置于30 ℃培养箱中培养3～5 d，并计算致死率。根据ARTP诱变致死率曲线确定最佳诱变处理时间。致死率的计算公式如下：

1.3.1.3 1,2,4-三氮唑梯度浓度平板法筛选突变菌株

将熔化好的YPD固体培养基倒入直径为9 cm的无菌培养皿中，倾斜一定角度（约15°），使得位于液面高处的培养基处于培养皿边与皿底之间，待其凝固后，水平放置培养皿，将含有2 g/L 1,2,4-三氮唑的YPD培养基加入其中，制得含有不同质量浓度1,2,4-三氮唑（0～2 g/L）的固体平板。随后将经过诱变并稀释好的酵母菌液均匀涂布于梯度平板中，倒置于30 ℃培养箱中静置培养3～5 d，观察不同质量浓度梯度下菌体的生长情况，并验证在高质量浓度抗性下生长的菌落与其谷胱甘肽产量是否正相关。

1.3.1.4 对数生长期初筛菌株在最佳ARTP诱变时间下的ARTP诱变

将经过ARTP诱变及梯度平板筛选获得的优势菌株，在最佳诱变时间下再次处理，随后均匀涂布于YPD固体平板中，挑选单菌落用于后续MMC适应性进化。通过ARTP诱变和MMC筛选后获得的毕赤酵母菌株，在30 ℃、220 r/min条件下进行摇瓶培养，测定其谷胱甘肽产量和细胞生物量，以优选高产谷胱甘肽的诱变菌株。

1.3.2 DTNB法测定谷胱甘肽产量

取2 mL摇瓶培养液，8000 r/min离心5 min后获得上清液和细胞沉淀，使用上清液检测胞外谷胱甘肽产量，使用细胞沉淀检测胞内谷胱甘肽产量，本实验谷胱甘肽总产量为胞外和胞内产量之和[25-26]。对于胞内谷胱甘肽的检测需要额外使用40%乙醇溶液，30 ℃水浴破壁2 h，8000 r/min离心5 min后取上清液进行显色反应。在pH 8.0的Tri-HCl缓冲液中，谷胱甘肽与DTNB反应可以生成黄色的5-硫代-2硝基苯甲酸，在波长412 nm处有最大吸收峰，利用酶标仪检测OD412nm，通过标准曲线法检测谷胱甘肽产量[27]。

1.3.3 细胞生物量的测定

取2 mL摇瓶培养液，8000 r/min离心5 min，弃上清液，而后用蒸馏水洗涤菌体3 次，85 ℃烘干至质量恒定，减去空离心管质量后除以摇瓶培养液体积2 mL即可得到细胞干质量（g/L）。

1.3.4 优选菌株的MMC适应性进化

将经过ARTP诱变且经过摇瓶培养证实生产性能较稳定的菌株BY-1-26，接入到YPD液体培养基中，30 ℃、220 r/min条件下过夜培养，调节OD600nm，使其控制在1.0以下。设置传代方式（time）及传代参数（24 h）后，在不同浓度梯度的1,2,4-三氮唑筛选因子条件下进行BY-1-26菌株的MMC适应性进化，实时检测OD600nm以跟踪菌株的适应性进化生长情况。随着培养时间的延长，1,2,4-三氮唑浓度逐渐递增，达到最高设定浓度时，将生长情况良好的液滴提取出来，通过平板划线，分离单菌落后，作为下次实验的出发菌株。

1.3.5 突变菌株遗传稳定性分析

将最终经过筛选获得的优势菌株，经过固体平板划线连续传代7 次，于30 ℃、220 r/min条件下检测每代的生长情况（生物量）及谷胱甘肽产量，验证其遗传稳定性。

1.4 数据处理

实验数据采用Excel 2019进行处理，图像采用Origin 2018进行绘制。实验结果以表示。

2 结果与分析

2.1 毕赤酵母菌株的ARTP诱变筛选条件

BY-1毕赤酵母菌株为ARTP诱变的出发菌株，其具有代谢产生谷胱甘肽能力，已知其在摇瓶培养48 h可达到最高谷胱甘肽产量（胞内产量与胞外产量总量）（133.24±0.86）mg/L，对应生物量（15.22±0.21）g/L（图1a）。图1b为BY-1菌株在MMC培养中的生长曲线，不同液滴培养单元之间一致性良好，菌株BY-1从3 h起开始进入对数生长期，20 h后进入稳定期。进一步检测BY-1菌株在不同ARTP诱变处理时间下的致死率，由图1c可知，随着处理时间的延长，菌株的死亡率也在逐渐提高。处理时间为120 s时，致死率高达80%；处理时间增加到160 s，致死率为90%；进一步增加处理时间至200 s，致死率达到100%。根据文献报道[28]，致死率在80%～90%之间，更有利于后续诱变菌株的筛选工作。为此，考虑到诱变菌株的筛选效率，本研究将160 s确定为后续ARTP诱变的最佳处理时间。

图1 菌株BY-1的谷胱甘肽产量及生物量（a）、生长曲线（b）和ARTP诱变致死率曲线（c）Fig.1 GSH yield and biomass (a),growth curve (b) and ARTP mutagenicity lethality curve (c) of strain BY-1

2.2 突变菌株的筛选结果

毕赤酵母经ARTP诱变后，涂布在含有梯度质量浓度（0～2 g/L）的1,2,4-三氮唑YPD培养基中，培养3 d，如图2a所示，在相对低质量浓度1,2,4-三氮唑培养基中，诱变菌株生长良好，数量多且菌落形态较大。随着1,2,4-三氮唑质量浓度增大，毕赤酵母生长情况受到抑制，形态变小且数量减少。平板中高质量浓度与低浓度区域分别选取30 个单菌落，进行摇瓶培养验证。结果表明，低质量浓度抗性突变株的产量普遍低于高质量浓度抗性突变株，且低浓度区域谷胱甘肽产量的中位数明显低于高质量浓度区域（图2b）。在高质量浓度区域发现编号为26的突变株（图2a），其谷胱甘肽产量最高，达到（203.20±4.18）mg/L，将其命名为BY-1-26。在后续的ARTP诱变中，选择BY-1-26作为新的出发菌株。

图2 毕赤酵母诱变菌株梯度平板筛选结果（a）及其谷胱甘肽产量测定结果（b）Fig.2 Results of gradient plate screening (a) and yield of GSH produced by mutant (b)

2.3 摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑对毕赤酵母产谷胱甘肽的影响

已知1,2,4-三氮唑的抗性突变株具有较高的谷胱甘肽合成能力[29]。本研究通过ARTP诱变结合1,2,4-三氮唑梯度浓度的平板筛选方法，验证了其对高产谷胱甘肽的毕赤酵母菌株具有很好的筛选效果。目前尚无在发酵阶段添加1,2,4-三氮唑以提升谷胱甘肽产量的报道。因此需要确定好1,2,4-三氮唑在发酵过程中的适宜添加时间和添加浓度，以准确考察1,2,4-三氮唑对毕赤酵母发酵过程中产谷胱甘肽的影响。

2.3.1 摇瓶培养中初步添加1,2,4-三氮唑对谷胱甘肽产量的影响

在摇瓶培养的不同阶段添加1,2,4-三氮唑，会直接影响到菌体的生长及谷胱甘肽产量[30]。参考图2结果，选择1,2,4-三氮唑在“高质量浓度区域”的中位数质量浓度1.5 g/L初步进行摇瓶培养中的1,2,4-三氮唑添加实验。为此根据出发菌株的生长曲线（图1b），在菌株BY-1-26进入摇瓶培养的0、5、10、15、20、25、30 h分别添加1.5 g/L的1,2,4-三氮唑，以确定其生长曲线的不同阶段对菌株BY-1-26代谢产生谷胱甘肽的影响。以未加入1,2,4-三氮唑的BY-1-26菌株摇瓶培养实验为对照，分别分析加入1.5 g/L 1,2,4-三氮唑后摇瓶培养48、60、72 h后其谷胱甘肽产量。

如图3所示，摇瓶培养48 h后，诱变菌株BY-1-26生物量在48 h达到最高值，同时其谷胱甘肽产量也达到最大值，胞内谷胱甘肽达到（153.85±2.80）mg/L，胞外谷胱甘肽达到（49.34±2.11）mg/L，总量达到（203.20±4.18）mg/L，比出发菌株增产52.51%。表明ARTP诱变可有效提升毕赤酵母菌株BY-1代谢产生谷胱甘肽的能力。

图3 菌株BY-1-26在不同培养时间下的谷胱甘肽产量（a）和生物量（b）Fig.3 GSH yield (a) and biomass (b) of strain BY-1-26 at different incubation times

进一步加入1,2,4-三氮唑，摇瓶培养48 h 后（图4a），胞外谷胱甘肽产量增加3.9%～80.9%，达到89.25 mg/L，胞内谷胱甘肽产量降低5.3%～33.9%，达到101.73 mg/L，推测加入1,2,4-三氮唑使BY-1-26菌株细胞壁渗透性增强，使代谢产生的谷胱甘肽更容易从胞内释放到胞外。不同时间添加1,2,4-三氮唑的样本相比，谷胱甘肽总量分别在培养5、10、20 h加入1,2,4-三氮唑的样本中有所增加（2.3%～9.2%），而在培养0、15、25、30 h后加入1,2,4-三氮唑的样本中有所减少（3.3%～17.9%），在摇瓶培养10 h后加入1,2,4-三氮唑的样本，谷胱甘肽产量增加最多（9.2%，221.83 mg/L），推测可能与对数期菌株细胞壁通透性更容易受1,2,4-三氮唑影响，谷胱甘肽释放到胞外有利于解除产物抑制促进菌株谷胱甘肽的进一步合成[31]。

摇瓶培养60 h后（图4b），与培养48 h（图4a）相比，胞内谷胱甘肽产量略有提高（1.38%，133.06 mg/L），胞外谷胱甘肽平均产量显著降低为48 h 的94.06%（61.91 mg/L），推测可能与长时间发酵营养物质损耗及菌株代谢能力降低有关。与未加入1,2,4-三氮唑（图3a）相比，加入1,2,4-三氮唑的样本，胞内谷胱甘肽产量减少9.4%～26.1%，胞外谷胱甘肽产量变为93.6%～162.7%，总量变为91.1%～104.9%。其中，摇瓶培养10 h后加入1,2,4-三氮唑的样本中谷胱甘肽总量最高（210.46 mg/L），其中胞外谷胱甘肽产量提高62.7%（78.49 mg/L），胞内谷胱甘肽产量下降13.4%（131.97 mg/L）。

摇瓶培养72 h后（图4c），与培养60 h（图4b）相比，胞内谷胱甘肽产量与胞外谷胱甘肽产量分别显著降低为60 h的28.52%（37.82 mg/L）和70.43%（42.39 mg/L）。推测长时间发酵使菌株代谢生长所需的营养物质严重不足。与未加入1,2,4-三氮唑（图3a）相比，加入1,2,4-三氮唑的样本，胞内谷胱甘肽产量减少24.19%～28.41%，胞外谷胱甘肽产量变为80.00%～104.18%，总量变为38.38%～44.60%（73.72～85.65 mg/L）。其中，摇瓶培养20 h后加入1,2,4-三氮唑的样本中谷胱甘肽总量最高（85.65 mg/L），胞外谷胱甘肽产量47.83 mg/L，胞内谷胱甘肽产量37.82 mg/L。

图4 不同时间添加1,2,4-三氮唑对48（a）、60 h（b）和72 h（c）培养液中谷胱甘肽的影响Fig.4 Effects of different addition times of 1,2,4-triazole on GSH yield in 48 (a),60 (b) and 72 h (c) cultures

综上，与出发菌株相比（（133.24±0.86）mg/L），ARTP诱变可以显著提高BY-1-26菌株在发酵48 h的谷胱甘肽产量52.51%（（203.20±4.18）mg/L）；在摇瓶培养10 h添加1,2,4-三氮唑有助于胞内谷胱甘肽释放到胞外，可以进一步提高其在发酵48 h的谷胱甘肽产量66.49%（（221.83±2.10）mg/L）。诱变菌株在摇瓶培养48 h其谷胱甘肽产量达到最高值，随着培养时间延长到60 h和72 h，其谷胱甘肽产量持续下降。

2.3.2 摇瓶培养过程中添加高质量浓度1,2,4-三氮唑对毕赤酵母产谷胱甘肽的影响

由2.3.1节结果可知，在摇瓶培养10 h添加1,2,4-三氮唑可显著提高菌株的谷胱甘肽产量。为了进一步探索更高质量浓度1,2,4-三氮唑对诱变菌株代谢谷胱甘肽的影响，继续尝试在摇瓶培养10 h添加终质量浓度为1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 g/L的1,2,4-三氮唑，并且分别在48 h测定谷胱甘肽产量和生物量，结果如图5所示。与未加入1,2,4-三氮唑（图3）相比，菌株在48 h的生物量（（15.66±0.49）g/L）基本没有变化；菌株在48 h的谷胱甘肽产量提高2.66%～13.22%，其中，加入终质量浓度为2.4 g/L 1,2,4-三氮唑的样本谷胱甘肽产量最高，提高13.22%（（230.07±1.26）mg/L）。与加入1.5 g/L的1,2,4-三氮唑的样本（图3a，（221.83±2.10）mg/L）相比，其谷胱甘肽产量有进一步增加；与出发菌株相比（（133.24±0.86）mg/L），提高72.67%。以上研究表明，提高1,2,4-三氮唑质量浓度可以进一步提高毕赤酵母菌株产谷胱甘肽的能力。

图5 添加不同质量浓度1,2,4-三氮唑于BY-1-26菌株摇瓶培养液培养48 h后的谷胱甘肽产量（a）和生物量（b）Fig.5 GSH yield (a) and biomass (b) of BY-1-26 after 48 h shake flask culture with the addition of different concentrations of 1,2,4-triazole

2.4 BY-1-26菌株在高质量浓度1,2,4-三氮唑条件下的MMC适应性进化

以上实验证实，ARTP诱变技术结合添加1,2,4-三氮唑培养可以有效筛选并促进毕赤酵母菌株高产谷胱甘肽。为此，本研究使用MMC仪，继续对诱变菌株BY-1-26进行1,2,4-三氮唑的适应性进化。

2.4.1 BY-1-26菌株对1,2,4-三氮唑的适应进化质量浓度分析

基于2.3节实验，BY-1-26菌株培养液可以耐受2.8 g/L的1,2,4-三氮唑。在MMC体系初步尝试在更大的0～5 g/L质量浓度范围内检测1,2,4-三氮唑对BY-1-26菌株的适应性进化影响。根据24 个液滴在8 个质量浓度梯度的生长曲线（图6a），当1,2,4-三氮唑质量浓度增加到4.444 g/L时，BY-1-26菌株的生长尽管受到一定抑制，其仍显示出较好的生长趋势。BY-1-26菌株在0～10 g/L范围内的适应性进化曲线（图6b）显示，BY-1-26菌株在10 g/L 1,2,4-三氮唑质量浓度条件下显示明显的不均一性，表明其生长一致性受到影响。BY-1-26菌株在10～12 g/L范围内的适应性进化曲线（图6c）显示，BY-1-26菌株在12 g/L的1,2,4-三氮唑质量浓度显示明显的不均一性。BY-1-26菌株在更高的1,2,4-三氮唑质量浓度（12～15 g/L）下无法显示规律性的适应性进化曲线（图6d）。因此，本研究将BY-1-26菌株对1,2,4-三氮唑的适应进化浓度范围设定为5～12 g/L，以获得可耐受更高1,2,4-三氮唑抗性的毕赤酵母菌株。

图6 菌株BY-1-26在不同1,2,4-三氮唑质量浓度下的生长结果Fig.6 Growth status of strain BY-1-26 with different 1,2,4-triazole concentrations

使用MMC体系将BY-1-26菌株在5～12 g/L的1,2,4-三氮唑质量浓度范围下进行1 轮适应性进化后，挑选长势较好的液滴提取出来，通过划线培养，提取单菌落菌株，继续进行下一轮适应性进化，以此类推，直到获得耐受较高质量浓度（接近12 g/L）1,2,4-三氮唑且适应性进化曲线良好的菌株。最终挑选了24 个液滴进行后续的菌株纯化和摇瓶培养验证实验。

2.4.2 适应性进化菌株的生物量和谷胱甘肽产量分析

将经过适应性进化得到的24 个液滴，经过平板划线，挑取单菌落，各得到1 株分离的单菌株。将分离的24 个单菌株进一步进行摇瓶培养，培养48 h后，检测每个菌株胞内和胞外谷胱甘肽含量。

经过MMC适应性进化，摇瓶培养后，24 个菌株的谷胱甘肽平均产量达到（292.68±7.76）mg/L（图7a），对比适应性进化之前BY-1-26菌株的谷胱甘肽产量（图3a，（203.20±4.18）mg/L），进一步提高了44.04%。其中胞外平均产量为（64.39±2.57）mg/L，对比适应性进化之前BY-1-26菌株的胞外产量（（49.34±2.11）mg/L），提高了30.50%；胞内平均产量为（228.33±6.55）mg/L，对比适应性进化之前B Y-1-26 菌株的胞内产量（（153.85±2.80）m g/L），提高了48.41%。24 个菌株的平均生物量达到（31.75±2.02）g/L（图7 b），与未经过MMC适应性进化生物量相比（图3 b，（15.65±0.43）g/L），提高了102.8%，表明MMC适应性进化促进了菌株的生长能力。推测通过MMC适应性进化，加强了诱变菌株谷胱甘肽的胞外渗透性，促进了菌株代谢合成谷胱甘肽的能力。其中液滴编号为24的菌株谷胱甘肽产量最高，达到（312.13±2.62）mg/L，相比BY-1-26的谷胱甘肽产量（（203.20±4.18）mg/L）提高53.61%，将其命名为BY-2-24。由此可以得出结论，经过ARTP诱变所得到的菌株，将其接入MMC进行适应性进化培养后，菌株的生长能力得到加强，而且其谷胱甘肽生产能力也高于驯化之前，更为诱变育种之后的筛选方法提供了新的尝试。

图7 摇瓶培养适应高质量浓度1,2,4-三氮唑进化的毕赤酵母菌株谷胱甘肽产量（a）和生物量（b）Fig.7 GSH yield (a) and biomass (b) of 24 single strains obtained by adaptive evolution with high concentrations of 1,2,4-triazoles

2.4.3 适应性进化的高产谷胱甘肽菌株的遗传稳定性

为了验证突变菌株遗传性状是否稳定，将毕赤酵母BY-2-24连续传代培养7 次，进行摇瓶发酵培养，待发酵结束测定每代的谷胱甘肽产量和生物量，如图8所示，经过7 次固体平板划线培养，BY-2-24仍能保持较好的生长趋势，每代的谷胱甘肽产量波动较小、基本稳定（（310.17±3.87）mg/L），生物量稳定在（32.67±0.55）g/L。由此说明经过诱变及驯化获得的突变株，其遗传稳定性良好，为后续谷胱甘肽的发酵生产研究提供了稳定的菌种。

图8 传代培养7 次后毕赤酵母BY-2-24的谷胱甘肽产量（a）和生物量（b）Fig.8 GSH yield (a) and biomass (b) of P.pastoris BY-2-24 after one to seven passages

3 结论

通过ARTP诱变技术与MMC适应性进化相结合，构建了一种谷胱甘肽高产毕赤酵母菌株的高效诱变筛选方法。以毕赤酵母菌株BY-1为出发菌株，通过ARTP诱变初步提高菌株BY-1-26的谷胱甘肽产量52.51%，达到（203.20±4.18）mg/L，进一步通过在摇瓶培养10 h加入终质量浓度为2.4 g/L的1,2,4-三氮唑，提高了菌株的谷胱甘肽产量72.67%，达到（230.07±1.26）mg/L，而对菌株的生物量基本无影响（提高2.9%，达到（15.66±0.49）mg/L）。本研究最终经过高质量浓度1,2,4-三氮唑（5～12 g/L）的MMC适应性进化，提高毕赤酵母菌株BY-2-24生物量118.33%，达（33.23±0.60）g/L，其中提高胞外谷胱甘肽产量47.12%，达（67.57±1.12）mg/L，提高胞内谷胱甘肽产量179.15%，达（243.39±2.33）mg/L，提高谷胱甘肽总产量134.26%，达（312.13±2.62）mg/L。推测与出发菌株相比，诱变菌株谷胱甘肽的细胞壁渗透性增强，解除产物抑制，促进了菌株代谢合成谷胱甘肽的能力。目前传统的诱变育种方法主要是通过物理诱变（如紫外诱变）和化学诱变（如硫酸二乙酯诱变、甲基磺酸乙酯诱变）进行，陈叶福等[32]通过紫外诱变结合镉盐抗性筛选，最终获得了1 株谷胱甘肽产量达151.88 mg/L的酿酒酵母突变株，比出发菌株提高15.89%。孙姜等[33]通过制备酿酒酵母原生质体，利用多轮亚硝酸诱变处理，最终筛选到1 株胞内谷胱甘肽产量达14.85 mg/g干质量的突变菌株，仅比出发菌株的产量提升24%。另外，目前研究人员已经通过基因工程手段开展了高产谷胱甘肽酵母菌株的选育工作，高宇豪等[15]以毕赤酵母GS115为出发菌株，通过基因的串联表达、前体氨基酸的添加和优化柠檬酸钠添加量的方法，使得谷胱甘肽产量达到（371.12±8.47）mg/L，对比出发菌株提升288%。本实验以野生型毕赤酵母为出发菌株，最终谷胱甘肽产量提高134.26%，达（312.13±2.62）mg/L，相比传统的诱变筛选效率有了大幅提升。尽管与基因工程手段获得的产量相比尚有差距，后续可将BY-2-24菌株作为新的基因工程出发菌株，以进一步提升谷胱甘肽产量。

综上，本研究表明，1,2,4-三氮唑作为抗性筛选标记，不仅可以在梯度平板筛选过程中提高筛选效率，还可以在液体筛选（适应性进化）过程中发挥出色作用。本研究将ARTP结合微液滴培养技术联合运用于谷胱甘肽生产菌株的筛选过程，与传统的物理诱变、化学诱变和合成生物学手段相比，不仅操作简便，而且提升了筛选效率，为现代工业生产应用所需菌株的诱变筛选工作提供了一定的借鉴与参考。