碱性pH值提取对大豆油脂体稳定性及消化特性的影响

宋晗钰，钟明明，康梦雪，满 慧，王震霄，齐宝坤

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

在植物中，脂质通常以油脂体的形式存在，油脂体是植物细胞中贮存甘油三酯的亚细胞器，甘油三酯是种子萌发和幼苗生长的主要能源。通常，油脂体由磷脂单层包围的脂质核心组成，磷脂单层上覆盖着油体相关蛋白，类似于“锚”结构包裹在油脂体表面，例如oleosin、caleosin和steroleosin蛋白[1]。由于油脂体独特的磷脂层结构使其在水相中具有良好的分散性，形成天然的O/W乳液[2]且不再需要额外的乳化剂和均质化步骤[3]。油脂体与人工O/W乳液相比具有更好的乳化性、热稳定性和氧化稳定性，且油脂体富含脂肪酸、生育酚和植物甾醇等营养物质，具有良好的功效和应用价值[4]。作为功能性动物蛋白的替代品，来自植物的天然环保型乳化剂非常重要。大豆是重要的油料作物，可作为植物乳化剂的重要来源，应深入了解油脂体的相关特性。

在实际应用中，研究发现不同的酸碱度会影响食品的特性。不同pH值提取对油脂体的组成、结构和性质都有不同的影响，进而影响油脂体的利用率。Chen Yeming等[5]研究发现在不同pH值（6.5～11.0）下提取的油脂体外源蛋白含量随着pH值的升高而减少；Liu Chen等[6]发现碱性pH值处理可去除花生油脂体表面的部分蛋白质和磷脂，且在pH 11时表面吸附的蛋白质几乎完全去除，Zeta电位绝对值随着温度的升高和NaCl浓度的增高而降低，碱性pH值处理降低了花生油脂体的稳定性；Jin Weiping等[7]在中性（pH 6.3）和碱性（pH 11.0）条件下提取油茶油脂体，通过Turbiscan分析离子强度和温度对油脂体的物理稳定性，发现pH 11.0比pH 6.3下提取的更稳定。他们的研究呈相反趋势，这可能与以下原因有关：1）可能与不同的油料作物有关，不同油料作物在碱提过程中含有不同的外源蛋白，其等电点也不同，可能造成其Zeta电位不同，因此具有不同的稳定性；2）不同的提取条件会导致油脂体的蛋白质组成和油脂体乳液性质不同[8]。油脂体作为许多营养物质的重要载体，很少有研究油脂体消化前后脂滴的变化和其保护膜对游离脂肪酸释放率的影响[9]。

如上所述，在不同pH值条件下提取油脂体可能导致其含有不同数量和组成的外源蛋白。本研究在pH 8.0、9.0、10.0、11.0条件下提取大豆油脂体（soybean oil body，SOB），探究在不同碱性pH值条件下提取对SOB的组成、氧化稳定性、流变性能及消化特性的影响，旨在为SOB的广泛应用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆（东农42号） 东北农业大学大豆研究所；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京索莱宝科技有限公司；尼罗红、尼罗兰 美国Sigma公司；胃蛋白酶（≥2500 U/mg）、胰酶（≥250 U/mg）、胆盐 上海源叶生物科技有限公司；实验中所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GL-21 M高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；PHS-25型数显台式酸度计 上海雷磁公司；MODEL BE-210型垂直电泳仪 日本BIO CRAFT公司；Gel Doc EZ凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；Zetasizer Nano90型粒度及电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司；MCR 302型流变仪 奥地利安东帕公司；UV-2600紫外分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；INFINITE M200 PRO型多功能酶标仪 帝肯（上海）贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SOB的提取

参照武利春等[10]的方法并稍作修改。洗净的大豆以固液比为1∶5（g/mL）在4 ℃的冰箱中放置18 h。将浸泡过的大豆与去离子水以1∶8（g/mL）的比例混合，使用组织破碎机以最大速率研磨90 s以获得浆液，将得到的浆液通过三层粗棉布进行过滤，以除去固体残渣并获得后续使用的豆浆，添加蔗糖（20%），冰水浴搅拌15 min，用1 mol/L NaOH溶液将pH值分别调节至8.0、9.0、10.0、11.0。将滤液4 ℃、10000×g离心30 min。收集上层乳状物，用蔗糖清洗耦合且用NaOH溶液分别调节pH值至8.0、9.0、10.0、11.0，将滤液4 ℃、10000×g离心30 min，收集上层乳状物。将收集的乳状物与水按1∶8（g/mL）的比例混合，用NaOH溶液分别调节pH值至8.0、9.0、10.0、11.0，将滤液4 ℃、10000×g离心30 min，得到4 种SOB，分别称为pH 8.0-OB、pH 9.0-OB、pH 10.0-OB和pH 11.0-OB。

1.3.2 SOB基本成分分析

未经稀释的新鲜SOB，水分含量、蛋白质含量和脂肪含量的测定分别参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[11]、GB/T 31578—2015《粮油检验 粮食及制品中粗蛋白测定 杜马斯燃烧法》[12]、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[13]。

1.3.3 SOB相关蛋白分离

参考Sun Yufan等[14]方法从SOB中分离出SOB相关蛋白。SOB用丙酮脱脂，在25 ℃下摇动30 min，并以15000×g离心5 min，然后使用吸管除去上层（丙酮）相，并收集底部颗粒，这个过程重复2 次以完全去除油脂。然后将蛋白颗粒置于氮气流中，以去除剩余的丙酮。分离出的SOB相关蛋白被冻干贮存，直到进一步使用。

1.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

参照Sun Yufan等[14]的方法并加以改进。将冻干的SOB相关蛋白溶解在10% SDS中，使蛋白质达到5%，在沸水中水浴加热5 min。将15 μL样品加到凝胶上，凝胶由5%的浓缩胶和15%的分离胶组成。浓缩胶和分离胶部分电压分别为80 mV和120 mV，直至染料达到凝胶底部。凝胶用考马斯亮蓝G-250染色30 min，然后脱色至条带清晰，用凝胶成像仪拍照。

1.3.5 SOB粒径、电位的测定

利用粒度及电位分析仪测定样品的平均粒径和Zeta电位，样品在测定前用磷酸盐缓冲液稀释到0.001%，分散相和连续相的折射率分别设置为1.456和1.333，测定温度为25 ℃，平衡时间为2 min。样品的平均直径用体积平均直径（D4,3）表示。

1.3.6 超高分辨显微镜观察

用磷酸盐缓冲液将新鲜制备的SOB乳液稀释5 倍，将所得溶液的10 mL等分试样用尼罗蓝（3 μL）溶液染色以标记界面蛋白（绿色荧光）和尼罗红（2 μL）溶液染色以标记内部甘油三酯（红色荧光）。在黑暗中25 ℃孵育30 min后，将5 μL等分试样置于显微镜载玻片上并盖上盖玻片。在配备×60油浸物镜的超高分辨率显微镜下以488 nm的激发波长观察样品。所有图像均使用数码相机附件以256×256像素分辨率、1.25 μm像素大小和25.2 μs像素停留时间捕获。

1.3.7 流变特性

通过流变仪测定SOB的流变特性。将SOB放置在测试托盘上（平行板直径=40 min，测试距离=0.5 min）以测定在25 ℃下剪切速率变化时黏度的变化。在线性黏弹性区域测定了SOB的储能模量（G′）和损耗模量（G″）随25 ℃振荡频率的变化而变化。

1.3.8 氢过氧化值（peroxide value，POV）测定

POV用于测定形成的初级氧化产物。取0.3 mL乳液加入1.5 mL异辛烷-异丙醇（3∶1，V/V），混合均匀。将所得混合物在25 ℃、2000×g离心5 min，取上清液。然后，将0.2 mL上清液与2.8 mL甲醇-正丁醇（2∶1，V/V）均匀混合，并加入15 μL的硫氰酸钾和15 μL的氯化亚铁。最后，将得到的混合物置于黑暗中20 min，并使用酶标仪测定波长510 nm处的吸光度，使用过氧化氢异丙苯混合物构建的标准曲线计算POV。

1.3.9 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的测定

将1 mL乳液和2 mL硫代巴比妥酸溶液（15%三氯乙酸和0.375%硫代巴比妥酸溶于0.25 mol/L盐酸中）混合，将混合物沸水浴加热15 min后冷却至室温，2000×g、25 ℃离心15 min，测定上清液在波长532 nm处的吸光度，以1,1,3,3-四乙氧基丙烷作标准曲线，计算样品中TBARS。

1.3.10 模拟体外消化

参考Li Yang等[15]构建的体外消化模型并稍作修改。

1.3.10.1 模拟胃消化

将5 mL样品与15 mL的模拟胃液（2 mg/mL NaCl、3.2 mg/mL胃蛋白酶）混合。随后，使用HCl/NaOH溶液（1 mol/L）将混合物的pH值调节至1.2，恒温水浴振荡器以100 r/min和37 ℃振荡混合物1 h。

1.3.10.2 模拟肠消化

首先取20 mL胃消化后的溶液，pH值调节至7.0。将8 mL的48.5 mg/mL胆汁盐、2 mL的750 mmol/L CaCl2溶液和10 mL的12 mg/mL胰脂肪酶溶液加入到上述胃消化液中，均匀混合。通过滴加NaOH溶液（0.2 mol/L）将所得混合物维持在pH 7.0。肠道消化在37 ℃下进行，使用恒温水浴振荡器以120 r/min连续摇动混合物2 h。

1.3.10.3 游离脂肪酸的测定

参照Ding Jian等[16]pH-stat方法对肠道消化期间释放的游离脂肪酸进行量化。由于在消化过程中pH值的变化仅归因于游离脂肪酸的释放，因此游离脂肪酸的释放量通过计算用于中和pH值的NaOH含量确定。按下式计算脂肪酸释放率：

式中：V（NaOH）为将pH值保持在7.0消耗的NaOH溶液体积/mL；M（NaOH）为NaOH浓度/（mol/L）；MLipid为大豆油的平均摩尔质量/（g/mol）；WLipid为大豆油的总质量/g。

1.3.10.4 样品观察

消化后的样品稀释至一定浓度，用于超高分辨显微镜研究，稀释后的乳液（10 mL）分别用3 μL尼罗蓝溶液和2 μL尼罗红溶液染色，观察样品。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 SOB基本组成

如表1所示，随着pH值的升高，水分和蛋白质含量呈现相同的趋势，水分质量分数从（51.86±0.48）%降至（37.88±0.31）%，蛋白质量分数从（2.78±0.06）%（pH 8.0-OB）降低到（2.03±0.08）%（pH 11.0-OB），这表明碱处理破坏了吸附蛋白和SOB之间的相互作用，而蛋白质可以与水分子结合，所以蛋白含量越高，水分含量也就越高[8]；脂质质量分数呈相反趋势，从（43.38±0.17）%增大到（55.16±0.04）%。综上所述，pH 11.0-OB的水分蛋白质含量最低，脂质含量最高。

表1 不同pH值提取SOB的基本组成Table 1 Basic composition of SOB extracted at different pHs

2.2 不同pH值提取SOB的SDS-PAGE

为进一步表征不同pH值提取对SOB蛋白组成的影响，测定SDS-PAGE如图1所示。SDS-PAGE可以粗略的估计蛋白质的分子质量，条带的暗度与每种蛋白质的浓度呈正比。SOB表面蛋白对维持SOB的稳定性有重要的作用，Tzen等[17]研究发现，α、α’、β、A亚基和Bd 30K属于外源蛋白，而分子质量为18 kDa和24 kDa的片段属于内源蛋白。与pH 11.0-OB相比，pH 8.0-OB、pH 9.0-OB和pH 10.0-OB的外源蛋白含量明显更高，且pH 8.0-OB的外源蛋白条带明显最强，由于这些蛋白之间的相互作用，可能导致SOB颗粒聚集[1]，也有可能形成有利于SOB结构完整性的保护层[18]，因此需要进一步粒径和Zeta电位的测定验证推测。

图1 不同pH值提取SOB的凝胶电泳Fig.1 SDS-PAGE patterns of SOB extracted at different pHs

2.3 不同pH值提取SOB粒径、电位和超高分辨显微镜观察

如表2所示，不同pH值提取的SOB平均粒径从大到小依次为：pH 8.0-OB（（471.57±8.53）nm）＞pH 9.0-OB（（462.30±3.78）nm）＞ pH 10.0-O B（（447.83±6.02）nm）＞ pH 11.0-O B（（424.77±12.21）nm）。图2显示不同pH值提取SOB液滴的微观结构和分布随着pH值从8.0增加到11.0，SOB的粒径逐渐减小，pH 11时SOB的平均粒径（（424.77±12.21）nm）最小，pH 11.0-OB显示出相似的粒径和良好的分散性（图2），这可能是由于高碱性pH值提取有利于洗脱外源蛋白，外源蛋白含量的高低与粒径大小呈正比，这与图1结果一致。pH 8.0和pH 11.0的Zeta电位分别为（-28.83±0.93）mV和（-20.57±0.85）mV，pH 8.0之间的静电斥力比pH 11.0之间的强，这是因为SOB的Zeta电位与其表面蛋白的净电荷有关，这取决于其所在溶液的pH值，在高于等电点的pH下，SOB表面蛋白的氨基为中性，羧基带负电，而pH 8.0-OB含有较多的外源蛋白可能是其较高负电荷的原因[1]，这也可能是由于低碱性条件下SOB表面上的外源蛋白之间的疏水相互作用[19]。

表2 不同pH值提取SOB粒径和Zeta电位Table 2 Particle sizes and zeta potentials of SOB extracted at different pHs

图2 不同pH值提取SOB的超高分辨显微镜观察和粒度分布Fig.2 URM observation and particle size distribution of SOB extracted at different pHs

2.4 pH值对SOB乳液氧化稳定性的影响

食物中的脂质氧化可能导致酸败甚至产生潜在的有毒物质。如图3所示，POV含量在贮藏的前8 d迅速增加，并在第8天达到最大值，而后逐渐降低。POV含量随着pH值的增加而降低，可能很大程度上取决于与颗粒大小密切相关的颗粒界面覆盖率，因此pH 8.0-OB比pH 11.0-OB高，主要是由于pH 8.0条件下SOB具有较大的粒径[20]，pH 11.0-OB的POV含量最低，贮存期间范围为1.38～2.75 mmol/kg。脂质氧化过程中产生的主要次级氧化产物之一是丙二醛，在加热的条件下，丙二醛和硫代巴比妥酸结合会产生红色的物质，这代表脂质二次氧化的程度，因此，TBARS值用于测定乳液中二次氧化的程度[21]。在贮存期间，观察到TBARS含量随时间延长而逐渐增加，其变化与POV相似，顺序为pH 8.0-OB＞pH 9.0-OB＞pH 10.0-OB＞pH 11.0-OB。出现这种现象可以解释如下：第一，主要是由于初级氧化产物的降解，转化为次级氧化产物，导致次级氧化产物的不断积累。第二，SOB的外源蛋白中含有水解油体蛋白的内源性蛋白酶和磷脂酶D，从而将SOB的甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂和游离脂肪酸暴露于外部，更容易与氧气接触，导致氧化速度加快[8]。

图3 不同pH值提取SOB的氧化稳定性Fig.3 Effects of different extraction pHs on the oxidative stability of SOB

2.5 不同pH值提取SOB的流变性质

流变特性被认为是评估乳液的质地、保质期和感官特性的最重要的性质。如图4A所示，所有SOB乳液的表观黏度都随着剪切速率的增加而降低，表明乳液产生剪切稀化行为。在低剪切速率下，SOB的表观黏度随着剪切速率的增加而急剧下降，这说明SOB表现出假塑性流体的特征，超过一定的剪切速率，表观黏度没有发生进一步变化[6]。这种剪切稀化行为是由于蛋白质絮凝结构的破坏[22]，导致流动阻力降低，从而降低黏度。值得注意的是，黏度随着pH值的升高而降低，这可能与静电相互作用的强度直接相关[23]。

如图4B所示，G’反映了材料的弹性（固体）性质，也被称为弹性模量，G”与材料的黏度（液体）特性有关，因此也被称为黏度模量[24]。所有样品的G’都大于G”，表明4 种OB都是黏弹性系统，这意味着它们都具有类似固体的行为[25]。pH 8.0-OB的G’最大，这可能是pH 8.0-OB的乳液液滴密集堆积，导致液滴流动性低且抗变形能力增强。黏度和模量越高，乳液的网络结构越致密，乳液的流动受到更多的限制，相分离越弱[26]。这些结果表明，吸附在SOB表面的不同蛋白质含量对SOB的流变特性有重要影响。

图4 不同pH值提取SOB流变分析Fig.4 Rheological analysis of SOB extracted at different pHs

2.6 pH值对SOB体外消化的影响

如图5、表3所示，在胃消化阶段，SOB粒径迅速增加，初始时4 种SOB的粒径为424.77 nm到471.57 nm之间，经过胃消化后，SOB粒径范围变为1208.33 nm到2701.33 nm，颗粒所带负电荷的绝对值显著下降（P＜0.05）。如图5所示，所有SOB都处于不稳定的状态，出现了明显的相分离，染成红色的蛋白质含量随着消化时间的延长而减少，发生这种现象可能有2 种原因：第一，由于SOB表面的蛋白质被胃液中的胃蛋白酶水解，降低了静电排斥力和空间位阻，破坏了SOB的稳定性，液滴发生聚集[1]。第二，SOB界面膜蛋白上的氨基和羧基逐步质子化导致正电荷增加，负电荷减小，促进了SOB膜上阴离子分子和阳离子斑块之间的桥接絮凝[27]。

表3 不同pH值提取SOB消化特性分析Table 3 Analysis of digestive characteristics of SOB extracted at different pHs

图5 不同pH值提取SOB消化物的超高分辨显微镜观察图像Fig.5 Ultra-high resolution micrographs of gastrointestinal digests of SOB extracted at different pH values

肠消化阶段，超高分辨显微镜观察图像显示油相和蛋白质发生“分离”，这可能是肠道中的胰酶会渗透到微粒中，导致其界面层受到侵蚀，从而使油相无法得到适当的覆盖和保护[28]。4 种SOB的平均粒径显著降低（P＜0.05），但仍高于初始乳液，SOB进入肠道后，观察到pH 8.0-OB的脂质荧光信号低于其他pH值提取的SOB，这可能是由于pH 8.0-OB更能抵抗脂质分解，肠液消化120 min后，蛋白（红色）信号减弱，油滴数量减少。乳液的Zeta电位绝对值与胃阶段相比显著增加，这可能是由于小肠中的阴离子物质（如胆汁盐）吸附到油滴表面[29]。Zeta电位与粒径结果一致，因为较大的颗粒表明乳液液滴聚集并形成了不稳定的系统。在肠消化阶段，Zeta电位的范围在（-11.1±0.20）mV到（-19.50±2.50）mV之间，pH 11.0-OB比pH 8.0-OB的Zeta电位绝对值大，这可能表明在消化过程中破坏了SOB表面的外源蛋白，导致pH8.0-OB不稳定。

由图6可以看出，在肠消化的前20 min，4 种SOB的游离脂肪酸释放率不断增加，然后逐渐减少。游离脂肪酸释放率受到液滴大小、界面成分和结构等多种因素的影响[30]。在模拟消化结束时，4 种SOB的游离脂肪酸释放率分别为：45.81%（pH 8.0-OB）、55.25%（pH 9.0-OB）、62.46%（pH 10.0-OB）和75.50%（pH 11.0-OB）。pH 11.0-OB的游离脂肪酸释放率最高，这可能是由于pH 11.0-OB的颗粒最小，较小的液滴具有较大的表面积，可以促进更多的的酶吸附并且易于进入界面[1]。pH 8.0-OB的游离脂肪酸释放速率较慢可能是因为SOB外层吸附较多的外源蛋白，结构更致密，从而延迟和减缓了脂肪的分解。肠消化后期游离脂肪酸释放率的降低可能是由于脂肪酸的聚集导致脂肪酶在油水界面上的吸附减少[31]。

图6 不同pH值提取SOB在体外模拟消化模型中的脂肪酸释放率Fig.6 Release percentage of FFA from SOB extracted at different pHs in an in vitro simulated digestion model

3 结论

本实验揭示了碱性pH值提取的SOB在氧化稳定性、流变及消化特性方面的影响，为SOB的应用提供了参考。结论如下：利用pH 8.0、9.0、10.0、11.0从大豆中提取了SOB，它们的外源蛋白含量按pH 8.0-OB、9.0-OB、10.0-OB、11.0-OB的顺序逐渐降低。SOB的平均粒径和Zeta电位随pH值的升高而降低，氧化稳定性实验表明，POV和TBARS值都随着pH值的升高而降低，表观黏度随剪切速率的增加而下降，4 种SOB都属于黏弹性系统，pH 11.0-OB的氧化稳定性好于pH 8.0-OB、9.0-OB和10.0-OB；体外消化实验表明，SOB粒径在胃消化阶段较初始乳液显著增加，经肠消化后粒径较胃消化阶段明显减小，但仍高于初始乳液；游离脂肪酸释放率随pH值的增加而增加，pH 8.0-OB达到了油脂的缓释效果。研究表明，不同pH值提取的SOB乳液外源蛋白含量不同，吸附在SOB表面的蛋白质影响了SOB的性质。