甘薯IbbZIP22基因克隆与表达分析

孟鑫王庆美侯夫云李爱贤董顺旭周媛媛秦桢张立明

(1.青岛农业大学农学院，山东 青岛 266109；2.山东省农业科学院作物研究所/农业农村部黄淮海薯类科学观测实验站，山东 济南 250100；3.山东省农业科学院，山东 济南 250100；4.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014)

甘薯(Ipomoea batatasL.)为旋花科甘薯属的藤本植物，是我国重要的粮食和经济作物[1]。因具有高产稳产、适应性强、经济效益好等诸多优势，甘薯种植遍布世界100多个国家[2]。块根作为甘薯的重要收获器官，富含淀粉、维生素和矿质元素等营养物质[3]，其中淀粉的含量和组成是甘薯产量和品质的主要决定因素[4]。

碱性亮氨酸拉链(bZIP)是家族成员众多的一类转录因子，在真核生物转录因子中分布最广泛、最保守[5]。bZIP转录因子家族具有一个bZIP结构域，由碱性区和亮氨酸拉链区两部分组成，碱性区含有识别并结合启动子上特定序列N-x7-R/K的基序；亮氨酸拉链区具有寡聚功能，行使转录激活或抑制功能。bZIP蛋白不仅参与植物的生长发育过程，而且参与响应逆境胁迫[6]。

有研究表明，bZIP转录因子可调控淀粉代谢途径。ZmbZIP22基因过表达导致玉米和水稻中糖的含量、淀粉的结构和含量以及淀粉合成基因的表达水平发生变化[7]。bZIP基因参与木薯ABA信号通路且影响块根淀粉积累[8]。然而bZIP转录因子在调节甘薯淀粉代谢途径中的作用尚不清楚。本研究以济薯25为材料，克隆得到IbbZIP22的基因序列及其启动子序列，并对其含有的顺式元件及在济薯25和徐紫薯8号中的表达模式进行了分析，以期为深入研究IbbZIP22基因功能及进一步解析该基因调节甘薯淀粉代谢的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年11月在山东省农业科学院作物研究所甘薯试验基地进行。本研究用到的植物材料有甘薯栽培品种济薯25(淀粉含量为22.6%)和徐紫薯8号(淀粉含量为18.0%)。将两个甘薯品种的块根种于大棚中的花盆内，重复3次，30 d后剪取长势良好且大小一致、长度约为10 cm的甘薯嫩枝若干，在24℃恒温室用Hoagland营养液进行水培，14 d后分别对块根、须根、茎、叶取样，经液氮快速冷冻，置于-80℃超低温冰箱保存，用于后续表达分析。

1.2 试验方法

1.2.1IbbZIP22基因克隆 使用Trizol法提取济薯25块根的总RNA，使用TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA第一链。以野生甘薯(Ipomoea trifida)的ItZIP22基因CDS序列为模板，用Primer Premier 5软件设计克隆引物(表1)，以济薯25的cDNA为模板，使用LA酶进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL:10×Buffer 2μL，dNTPmix 1μL，正反向引物各0.5μL，cDNA模板1μL，LA酶0.2μL，ddH2O补足到20μL。反应程序为95℃预变性2 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸1 min，共35个循环；68℃延伸5 min。扩增后的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA胶回收试剂盒(TIANGEN，北京)回收目的片段；将目的片段连接007VS-T载体并转化到DH5α感受态中，挑选阳性克隆送青岛擎科有限公司测序，保存测序正确菌液，完成克隆。

1.2.2IbbZIP22基因的生物信息学分析 使用NCBI ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析基因的ORF序列；利用NCBI的CDD数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析IbbZIP22蛋白的保守结构域；利用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在线工具分析IbbZIP22蛋白的理化性质；利用SOPMA(http://pbil.ibcp.fr/)在线网站对IbbZIP22蛋白的二级结构进行预测；利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)对IbbZIP22蛋白的三级结构进行预测；利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plantmulti/)对IbbZIP22蛋白进行亚细胞定位预测；在NCBI数据库中选取不同物种的bZIP22同源蛋白，利用MEGA 7.0软件构建系统发育进化树。

1.2.3IbbZIP22基因在两个甘薯品种不同部位的表达分析 根据获得的IbbZIP22基因的全长cDNA序列，设计qRT-PCR引物(表1)。使用Trizol法分别提取济薯25和徐紫薯8号的茎、叶、须根和块根的总RNA并合成cDNA，以IbActin序列为内参，以两个甘薯品种茎、叶、须根和块根的cDNA为模板进行qRT-PCR反应，该反应在罗氏公司的LightCycler®480ⅡPCR仪上进行。每个样品设置3次重复，基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法。

1.2.4IbbZIP22基因的启动子克隆与分析 根据IbbZIP22基因的cDNA序列，在I.trifida数据库中预测IbbZIP22基因上游2 000 bp的序列作为启动子扩增模板，利用济薯25叶片基因组DNA、bZIP-pro-S1/A1引物(表1)扩增启动子序列，连接纯化后的扩增产物至007VS-T克隆载体并转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆送青岛擎科生物技术有限公司测序，测序正确的序列利用PlantCARE在线进行顺式作用元件预测和分析。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 IbbZIP22基因的克隆

利用引物bZIP-S1和bZIP-A1，以济薯25块根cDNA为模板，通过PCR扩增及电泳检测，得到1 400 bp左右的目的条带(图1)。经测序，得到大小为1 368 bp的IbbZIP22基因CDS序列(图2)。

图1 IbbZIP22基因的克隆

图2 IbbZIP22基因cDNA序列和编码氨基酸序列

2.2 IbbZIP22基因的生物信息学分析

经ORF finder分析，IbbZIP22基因开放阅读框全长1 368 bp，编码455个氨基酸(图2)。利用NCBI分析保守结构域，发现该基因在第313～376位氨基酸残基上有bZIP＿plant＿RF2保守结构域(图3)，推测其属于RF2类bZIP转录因子。

图3 IbbZIP22基因的保守结构域分析

使用ExPASy在线分析IbbZIP22表达蛋白，推测该蛋白分子式为C2116H3402N632O702S24，相对分子量为49.6 kDa，其理论等电点为6.10，负电荷残基总数和正电荷残基总数分别为58和52；推测其半衰期为30 h，不稳定指数为56.65，脂肪族指数为65.21，亲水性总平均值为-0.649，推测IbbZIP22蛋白为亲水、不稳定蛋白。

通过SOPMA在线网站对IbbZIP22蛋白的二级结构进行预测，结果表明该蛋白含有α螺旋37.80%，β转角1.54%，折叠延伸链3.30%和无规卷曲57.36%(图4)；通过SWISS-MODEL预测并构建IbbZIP22蛋白的三级结构模型(图5)；通过Cell-PLoc2.0对IbbZIP22蛋白进行亚细胞定位预测，预测该蛋白位于细胞核中。

图5 IbbZIP22蛋白的三级结构预测

利用MEGA 7.0软件构建甘薯(Ipomoea batatasL.)和烟草(Nicotianatabacum，XP＿016451524)、可 可(Theobromacacao，XP＿017971734)、木 薯(Manihot esculenta，XP＿021610187)、三裂叶薯(Ipomoea triloba，XP＿031125140)、牵牛(Ipomoea nil，XP＿01916537)等16种植物基于bZIP同源蛋白的系统进化树，结果(图6)表明，甘薯的bZIP22蛋白与三裂叶薯的RF2a-like蛋白亲缘关系最近，其次是烟草的bZIP19-like蛋白，与月季、山梨猕猴桃的bZIP蛋白亲缘关系较远，符合系统分类学特征。

图6 IbbZIP22蛋白与其他植物同源蛋白进化分析

2.3 IbbZIP22基因在两个甘薯品种不同部位的表达分析

以IbActin作为内参基因，对济薯25和徐紫薯8号不同部位中IbbZIP22基因的表达进行分析，结果(图7)表明，IbbZIP22基因在两个品种的叶、茎、须根和块根中均有不同程度的表达，且均以块根中的表达量最高，显著高于在其他部位中的表达量。IbbZIP22基因在济薯25须根中、在徐紫薯8号叶中的表达量最低，显著低于其他部位。比较IbbZIP22在两个品种块根中的表达量(图8)发现，IbbZIP22基因在济薯25块根中的表达量显著高于徐紫薯8号，是徐紫薯8号的1.39倍。

图7 IbbZIP22基因在两个甘薯品种中的表达模式分析

图8 IbbZIP22基因在两个甘薯品种块根中的相对表达量

2.4 IbbZIP22基因的启动子克隆与分析

以济薯25基因组DNA为模板，通过PCR反应克隆得到长度为1 688 bp的启动子片段(图9)。利用PlantCARE在线软件对IbbZIP22基因的启动子进行预测，发现序列中除了含有TATAbox、CAAT-box等启动子核心元件，还包括光响应元件(GT1-motif，TCT-motif，MRE，ACE)、干旱胁迫的MYB响应元件(MBS)、参与低温响应的顺式作用元件(LTR)、玉米醇溶蛋白代谢调控中的顺式调控元件(O2-site)、厌氧诱导元件(ARE)及茉莉酸甲酯(TGACG-motif，CGTCA-motif)、脱落酸(ABRE)等激素相关的响应元件，以及一些功能未知的元件如MYB、MYC和STRE(表2)。

表2 IbbZIP22基因启动子作用元件分析

图9 IbbZIP22基因启动子的克隆

3 讨论与结论

碱性亮氨酸拉链(bZIP)家族的转录因子是真核生物许多器官发育和生理过程的主要调节因子，包括形态发生、种子形成、非生物和生物胁迫反应[9，10]。本研究从济薯25中克隆出IbbZIP22基因，根据保守结构域分析IbbZIP22蛋白含有bZIP＿plant＿RF2保守结构域，推测其属于RF2类bZIP转录因子。系统进化树分析结果表明，IbbZIP22蛋白与三裂叶薯的RF2a-like蛋白具有较高的同源性。

植物bZIP转录因子的研究进展大多与其参与非生物胁迫和发育有关，如种子成熟、花和维管发育、胁迫信号和病原体防御[11]。近年来，在小麦和玉米中bZIP转录因子参与淀粉合成的机理也逐渐被深入研究，结果表明，在过度表达TubZIP28的小麦中，成熟籽粒中的总淀粉含量升高，说明TubZIP28上调淀粉合成[12]。块根是甘薯贮存营养的器官，淀粉在甘薯块根中大量存在[13]。本研究选用济薯25和徐紫薯8号两个品种，对它们不同部位中IbbZIP22基因的表达进行分析，发现该基因在两个品种块根中均表达量最高。淀粉型品种济薯25的淀粉含量为22.6%，比淀粉含量18.0%的徐紫薯8号略高，本研究发现，IbbZIP22基因在济薯25号块根中的表达量显著高于徐紫薯8号，是徐紫薯8号的1.39倍，与这两个品种淀粉含量的高低趋势一致，因此推测IbbZIP22基因参与了淀粉的合成和代谢。

启动子是基因表达调控的重要元件。本研究发现IbbZIP22基因启动子上不仅包含核心元件TATA-box、CAAT-box等，还包含参与干旱诱导的MYB结合位点，推断该基因可能受MYB转录因子调控。此外，IbbZIP22基因启动子序列上还包含玉米醇溶蛋白代谢调控中的顺式调控元件，有研究表明，bZIP型转录因子ZmbZIP22可以直接与27 kDγ-玉米醇溶蛋白启动子结合，调节27 kDγ-玉米醇溶蛋白基因的表达[14]，因此，在甘薯中是否可能存在相应的调控机制也值得被深入探讨。该启动子也含有参与干旱、低温和光响应元件及与茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)反应的顺式作用元件，说明IbbZIP22基因可能在甘薯非生物胁迫应答等过程中发挥作用，而且该基因的表达可能受MeJA和ABA等激素的调控。

本研究克隆了甘薯的IbbZIP22基因及其启动子，并对该基因在不同淀粉含量品种中的表达进行了分析，可为探究甘薯抗逆和淀粉调控机制提供依据，并为进一步明确IbbZIP22基因的功能奠定基础。