利用CRISPR/Cas9技术创制糯稻种质

陈峰姜艳芳焦晓真张华朱文银姜明松徐建第

(1.山东省农业科学院湿地农业与生态研究所，山东 济南 250100；2.中国水稻研究所，浙江 杭州 311401；3.郯城县精华种业有限公司，山东 郯城 276000)

直链淀粉含量是决定稻米食味品质的重要性状，由颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)催化合成，主要受蜡质基因(Waxy，Wx)控制[1]。糯稻是指直链淀粉含量低于2.0%的水稻品种，糯米是制造粘性小吃、甜品和酿造甜米酒的主要原料，是一种重要的特色水稻类型[2]。

基因组编辑技术是指通过序列特异核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)对基因组特定位点进行靶向修饰的技术，主要原理是通过SSNs特异切割DNA靶位点，产生DNA双链断裂，诱导自身的损伤修复机制，从而实现对基因组的定向编辑。基因编辑技术是近几年发展起来的生命科学领域的革命性技术，成为水稻遗传育种研究的重要手段[3]。传统水稻品种改良主要是通过杂交、回交的方式将目标基因导入受体品种，实现优良基因的聚合，育种周期长，效率较低。而利用基因组编辑技术，可实现对基因组的定点修饰，克服传统育种中的连锁累赘，会大大提高育种效率。

CRISPR/Cas9系统是近几年发展迅速的高效、准确、便捷的基因组编辑技术。周鑫等[4]用CRISPR/Cas9系统对哈勃601的Wx基因进行定向突变，获得了糯性哈勃601材料。汪秉琨等[5]利用CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因，获得了低直链淀粉含量的楚粳27突变体材料。冯璇等[6]利用CRISPR/Cas9介导基因组编辑，培育出糯稻不育系WX209A。黄李春等[7]利用CRISPR/Cas9技术编辑Wx基因创制了8种淀粉精细结构略区别于传统糯稻的新型糯稻种质。范美英等[8]通过CRISPR/Cas9系统改良优质粳稻秀水134，获得了糯稻新材料。目前，利用CRISPR/Cas9系统改良黄淮粳稻品种品质的研究报道较少。圣稻22是山东省水稻研究所培育的粳稻品种，具有优质、抗病、丰产性好、适应范围广等优点[9]。本研究利用CRISPR/Cas9系统编辑圣稻22的Wx基因位点，以期得到直链淀粉含量下降的糯稻种质，为糯稻育种提供新材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料种植及性状调查

本试验选用的受体品种为山东省水稻研究所选育的粳稻品种圣稻22，该品种具有株型优良、抗性好、灌浆快、熟相好、出米率高等优点。基于圣稻22获得的Waxy位点编辑材料于2020年6月至2021年12月种植于山东省农业科学院湿地农业与生态研究所植物生长室。

按照《国家水稻品种试验观察记载项目、方法标准》进行生育期、株高、有效穗、穗长、穗粒数、千粒重等农艺性状调查。

1.2 基因敲除载体信息

大肠杆菌DH5α感受态细胞、EHA105农杆菌感受态细胞、CRISPR/Cas9载体由上海分生生物科技有限公司提供。使用的基因编辑载体为pRice-KO1(图1)，载体中OsU6用于启动sgRNA表达，玉米泛素基因启动子UBI用于启动Cas9表达。

图1 基因敲除载体pRice-KO1信息

1.3 靶位点的选择、sgRNA设计及载体构建

利用在线软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)[10]，在Wx基因(Os060133000)的第1外显子设计引物的靶序列(GCATGAACGTCGTGTTCGT)，该靶序列GC含量为55%，特异性好(图2)。

图2 靶位点在Wx基因的位置信息(绿色箭头指向的黄色框位置为靶序列)

根据所用敲除载体pRice-KO1的接头序列，合成引物 sgRNA-F(5′-GTGTGGCATGAACGTCGTGTTCGT-3′)、sgRNA-R(5′-AAACACGAACACGACGTTCATGCC-3′)；将包含10 μmol/L sgRNA-F 1μL、10μmol/L sgRNA-R 1 μL、重蒸水8μL的PCR体系置于PCR仪上，于95℃温育10 min使引物变性，然后以每秒0.1℃的变幅逐渐降低到20℃，使引物形成双链。然后与经BsaⅠ酶切的pRice-KO1按照正常的酶切连接流程进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态Top10，挑取抗性菌落用通用引物M13F和sgRNA-R进行PCR鉴定，鉴定正确的克隆提质粒后送上海生工生物工程有限公司测序进一步确认。

1.4 农杆菌介导的遗传转化

2020年3月，载体构建成功后由上海分生生物科技有限公司通过农杆菌介导对水稻愈伤组织进行遗传转化。转化步骤主要包括愈伤组织的诱导、愈伤组织的农杆菌侵染、抗性愈伤组织的筛选、抗性愈伤组织的分化及生根等，最终获得T0代苗[11]。

1.5 突变位点和无标记突变后代检测

CTAB法提取T0代转基因株系基因组DNA[12]，设计特异性引物Waxy-D-F/Waxy-D-R(表1)，扩增sgRNA靶向位点序列，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，送上海生工生物工程有限公司通过常规Sanger法进行测序。测序结果通过Geneious软件进行分析。

将T0代苗种植于温室中并收获种子，将种子种植后获得T1代苗。CTAB法提取的T1代单株幼叶DNA，以pRice-KO1载体特异引物M13F/KO1-R(表1)进行PCR扩增。PCR扩增体系15μL:模板DNA 1μL、M13F引物1μL、KO1-R引物1 μL，2×Master Mix 7.5μL(南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供)、ddH2O 4.5μL。PCR反应条件为95℃5 min；95℃25 s，55℃30 s，72℃30 s，34个循环；72℃延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测转基因载体分离情况，获得无标记突变后代。所用引物(表1)由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本研究所用引物信息

1.6 直链淀粉含量测定

2020年10月，蜡熟期收获T0代种子，晾干至14.5%含水量，用日本凯特Kett实验用小型精米机加工成精米，用Retch-MM400型打样机将精米打成米粉，过100目筛后用于直链淀粉含量测定。

稻米直链淀粉含量在扬州大学植物功能基因组学教育部重点实验室测定，测定方法参照黄李春等[7]的方法，RVA谱特征值的测定参照郭涛等[13]的方法。

2 结果与分析

2.1 T0代材料突变频率与类型

通过农杆菌介导法将Wx基因敲除载体转入受体材料后，共获得T0代独立株系20株(命名为C721-1—C721-20)。测序结果表明，共有16株发生突变，突变率为80%，其中纯合及双等位突变株4株(通过在线分析软件DSDecodeM分析，http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)；突变类型包括碱基缺失、插入等。部分株系的测序峰图见图3。

图3 部分T0代Wx基因敲除株系测序峰图

2.2 突变体直链淀粉含量和淀粉粘滞性谱测定

16个T0代突变株系中，有3个株系长势弱未收到种子，其余13个株系均收获种子且具有明显的糯稻表型，部分株系的稻米外观见图4。选7个结实正常、长势良好的株系，收获种子用于直链淀粉含量和RVA谱特征值测定，结果(表2)显示，C721-4、C721-11、C721-12直链淀粉含量降至2.0%以下，达到糯稻品质标准；另4个株系直链淀粉含量在2.10%～3.51%之间，也均显著低于野生型；稻米RVA谱特征值中的最高粘度、热浆粘度、冷胶粘度、回复值均明显低于对照品种。

表2 对照与T0代突变株系直链淀粉含量及RVA谱特征值

图4 部分T0代Wx基因敲除株系稻米外观

2.3 T1代转基因载体检测和无标记突变单株的选择

提取T1代单株幼叶DNA，以基因编辑载体特异引物进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖电泳检测，能扩增出载体序列的为阳性(含载体序列)，不能扩增出载体序列的为阴性(无载体序列)，共检测T1代240株，其中阳性单株208株，不含载体序列的单株32株(图5)。

图5 部分T1代基因编辑单株载体序列PCR检测结果

2.4 T1代突变株系的农艺性状鉴定

对32株不含标记序列的T1代突变单株进行农艺性状考查和糙米外观品质检测，其中10个T1代突变单株的抽穗期、株高、穗长、千粒重等与圣稻22相似，综合农艺性状优良，糙米外观品质检测均为糯米表型(表3)。

表3 部分T1代株系农艺性状与糙米外观表现鉴定

3 讨论与结论

我国科学家在水稻遗传学和功能基因组学领域已取得瞩目成就，发掘克隆出多个水稻产量、品质及抗性重要功能基因，为开展水稻分子设计育种奠定了基础。基因组编辑技术是研究基因功能和生物体改造的重要工具。CRISPR/Cas系通过一段向导RNA和配套的核酸酶就可对特定的基因组序列进行定点编辑，具有简单高效、应用广泛的特点，受到了生物学家的广泛关注，已广泛应用于玉米、小麦和水稻等作物改良[14-22]。

直链淀粉含量与稻米品质直接相关，Wx基因是控制水稻直链淀粉合成的主效基因，通过对Wx基因定点编辑可以获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体。周鑫等[4]在Wx基因的第2、7、8、10、11、12外显子区域设计6个靶位点，构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体，通过基因编辑粳稻品种哈勃601，获得5份纯合T2突变体，直链淀粉含量由亲本的15.5%降至2.0%～2.6%，接近或达到糯稻水平。汪秉琨等[5]构建CRISPR/Cas9表达载体pGK03-Wx-gRNA(靶点1和2分别在Wx基因第1和第2外显子)，利用工程菌EHA105遗传转化超级稻楚粳27，稻米直链淀粉含量从17.5%降到1.93%。黄李春等[7]编辑Wx基因编码的GBSSI蛋白C末端非关键位点(Wx基因第12和第13外显子)，利用CRISPR/Cas9技术进行编辑粳稻品种日本晴，直链淀粉含量从野生型的16.79%下降到3.69%～4.44%。本研究利用CRISPR/Cas9系统，以Wx基因(靶点位于第1外显子)为编辑对象构建敲除载体，利用农杆菌介导法转化优质粳稻品种圣稻22，共获得T0代独立株系20株，测序结果表明16个株系实现了对Wx基因的定点编辑，突变率为80%，纯合及双等位率为20%；T0代稻米外观品质检测表明13个株系外观呈现糯稻表型，直链淀粉含量测定表明有3个株系的直链淀粉含量降至2.0%以下。

综上，利用CRISPR/Cas9对Wx基因进行定向突变可以快速改良品种的直链淀粉含量目标性状，获得糯性水稻材料，在水稻品种的定向改良方面具有巨大的应用潜力。但在利用该技术培育新品种时，需要选择适当的靶位点并培育较多的突变体，才能从中选到符合国家标准的糯稻品种。另外本研究仅对T0代和T1代进行了遗传分析及表型鉴定，后续可对T2代株系进行进一步的基因型与表型鉴定，以获得稳定遗传、农艺性状优良的糯性种质。