双氢青蒿素减轻慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺损伤

秦玉春，邝向东*，蔡林再，谢景臣，陈 山

1.海南西部中心医院 呼吸与危重症医学科， 海南 儋州 571700；2.海南医学院附属第二医院 呼吸与危重症医学科，海南 海口 570311

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以气道炎性反应、肺结构纤维化破坏、气流持续受阻为特征的慢性肺疾病，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭等常见并发症，危及患者生命安全[1]。双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是一种青蒿素衍生物，广泛用作抗疟疾药物[2]。越来越多的证据表明DHA具有抗炎和抗器官纤维化作用[3-4]。然而，关于DHA对COPD的作用尚未见报道，作用机制亦不明确。白细胞介素(interleukin，IL)-6是大家公认的能介导COPD发病的关键促炎因子之一，高表达的IL-6可加重COPD病情，加速其进展[5]。信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是一类可以将胞外信号传导至胞核中的传导因子，参与细胞的分化、增殖、凋亡及免疫调节等生命活动，STAT3为STAT家族重要成员之一，已被证实其可被IL-6激活[6]。此外，一些研究表明，DHA能够抑制IL-6/STAT3信号通路[7-8]。基于此，本研究观察DHA对COPD大鼠气道炎性反应和肺组织损伤的影响，并探究抑制IL-6/STAT3信号通路作为DHA药理机制的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：6周龄雄性SD大鼠，SPF级，体质量200～220 g[北京华阜康生物科技公司，许可证号：SYXK(京)2019-0022]。适应性喂养5 d后进行实验，喂养条件：光照12 h/关灯12 h交替模式，温度22～26℃，湿度40%～60%，自由饮水、摄食。

1.1.2 试剂：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(北京康瑞纳生物科技有限公司)；双氧青蒿素(DHA)(北京万辉双鹤药业有限责任公司)；大鼠IL-6 antibody(R&D公司)；大鼠IL-6、IL-1β、IL-17和TNF-α ELISA试剂盒(Elabscience公司)；HE染色、Masson染色试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；瑞士-吉姆萨染色试剂盒(上海歌凡生物科技有限公司)；RIPA裂解液、ECL发光液和BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗大鼠一抗anti-GAPDH、anti-IL-6、anti-STAT3、anti-p-STAT3及HRP-山羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：参考文献[9]研究，采用气管内注入LPS联合熏烟法建立COPD模型。分别于第1天、14天麻醉大鼠，暴露气管并向气管内注入200 μL LPS(1 mg/mL)，对照组注入200 μL 0.9%氯化钠溶液；每天10：00 am将大鼠置于密闭烟熏箱(自制)内，用20支香烟烟熏30 min(第1天、14天除外)，持续28 d，对照组置于无烟的密闭烟熏箱内。

COPD大鼠模型建立成功之后(即第29天)，随机把COPD大鼠分为COPD组、低、高剂量DHA组(L-DHA、H-DHA，每天灌胃给予5、25 mg/kg)组、中和IL-6组(neutral-IL-6，每天腹腔注射大鼠IL-6 antibody 36 μg/kg)，持续14 d，每组7只。

1.2.2 ELISA检测BALF中炎性因子水平：于末次给药24 h后常规收集BALF，利用ELISA试剂盒检测上清中IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α水平。

1.2.3 计数BALF中细胞总数及炎性细胞分类数：常规计数BALF中的细胞总数(total cells)，利用细胞离心涂片机甩片及瑞氏-吉姆萨染色，于显微镜下计数BALF中嗜酸性粒细胞(eosinophil，Eos)、中性粒细胞(neutrophil，Neu)、淋巴细胞(lymphocyte，Lym)数目，计算各自所占比例。各自细胞数(个)=各自比例×BALF细胞总数。

1.2.4 HE染色、Masson染色观察肺组织病理改变：取BALF之后，摘取肺组织，分离左肺组织并将其置于4%多聚甲醛中固定24 h，经脱水、透明后进行石蜡包埋，制作4 μm厚的切片，烤干后进行常规HE染色、Masson染色，显微镜下观察病理改变。将右肺组织保存于-80℃待用。

1.2.5 Western blot检测肺组织中IL-6/STAT3信号通路相关蛋白表达：右肺组织中加入RIPA裂解液，匀浆、离心得上清，随后利用BCA试剂盒测定其浓度，定量、变性后进行凝胶电泳以使蛋白分离，而后转印、封闭，孵育兔抗大鼠一抗anti-GAPDH、anti-IL-6、anti-STAT3、anti-p-STAT3，而后孵育HRP-山羊抗兔二抗，最后滴加ECL发光液，借助凝胶成像分析仪检测蛋白条带，利用Image J进行吸光度分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组BALF中炎性因子水平

与对照组比较，COPD组BALF中IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α水平增加(P<0.05)，经L-DHA、H-DHA、中和IL-6干预后上述炎性因子水平减少(P<0.05)(表1)。

表1 各组BALF中炎性因子水平

2.2 各组BALF中细胞总数及炎性细胞分类数

与对照组比较，COPD组BALF中细胞总数及Eos、Neu、Lym细胞数增加(P<0.05)，经L-DHA、H-DHA、中和IL-6干预后上述细胞数减少(P<0.05)(表2)。

表2 各组BALF中细胞总数及炎性细胞分类数

2.3 各组肺组织病理改变

与对照组比较，HE染色显示，COPD组肺组织发生明显损伤，可见充血、水肿，上皮细胞坏死、脱落，肺间质内大量炎性细胞浸润，以及管壁增厚、管腔狭窄；Masson染色显示，COPD组气管周围可见大量胶原纤维沉积，纤维组织增生明显。经L-DHA、H-DHA、中和IL-6干预后上述病理改变减轻(图1,2)。

图1 各组肺组织HE染色

2.4 各组肺组织中IL-6/STAT3信号通路蛋白水平

与对照组比较，COPD组肺组织中IL-6蛋白及STAT3磷酸化水平增加(P<0.05)，经L-DHA、H-DHA、中和IL-6干预后上述蛋白减少(P<0.05)(图3,表3)。

表3 各组肺组织中IL-6/STAT3信号通路相关蛋白质表达

图2 各组肺组织Masson染色

图3 各组肺组织中IL-6/STAT3信号通路相关蛋白质表达

3 讨论

气道炎性反应被认为是COPD发生发展的主要驱动因素，其可导致不同肺腔室的Eos、Neu、Lym等炎性细胞大量增加，继而释放IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α等促炎因子，久之可导致肺结构损伤及纤维化，其中IL-6、TNF-α被认为是与COPD关联最为密切的促炎因子[10]。青蒿素是从中国草药黄花蒿中分离出来的一种活性成分，几十年来一直被用于治疗疟疾。DHA是青蒿素的半合成衍生物，除了具有显著的抗疟疾作用外， 还在抑制炎性反应[3]、 抗器官纤维化[4]、减轻氧化应激[11]等方面发挥作用。但关于DHA对COPD的作用目前仍未有研究报道。本研究结果显示，DHA能够降低COPD模型大鼠BALF中IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α促炎因子水平及细胞总数，Eos、Neu、Lym细胞数；以及减轻肺组织炎性细胞浸润及气管周围胶原纤维沉积，表明DHA能够减轻COPD大鼠气道炎性反应和肺组织损伤。

目前，对于参与炎性反应相关通路的研究较多，其中因IL-6是典型的促炎因子之一，而使IL-6/STAT3信号通路备受关注，被认为是抑制炎性反应的理想干预通路。IL-6/STAT3信号通路的作用机制为IL-6与其受体及辅受体糖蛋白130结合形成复合体后可促使STAT3磷酸化而激活，进而将胞外信号传导至胞内，调控促炎因子的表达而导致炎性反应发生[12-13]。此外，有报道称，DHA能够通过抑制IL-6/STAT3信号通路而抑制喉鳞癌上皮-间充质转化或改善卵清蛋白诱导的小鼠哮喘[7-8]，但DHA减轻COPD模型大鼠气道炎性反应和肺组织损伤是否与抑制IL-6/STAT3信号通路有关仍未可知。本研究结果显示，与对照组比较，COPD组肺组织中IL-6蛋白及STAT3磷酸化水平增加，经L-DHA、H-DHA干预后减少，表明能够抑制IL-6/STAT3信号通路。本研究同时设置中和IL-6干预为平行对照组，结果显示，中和IL-6后STAT3磷酸化蛋白水平减少，同时COPD模型大鼠气道炎性反应和肺组织损伤减轻。结合上述结果，推测抑制IL-6/STAT3信号通路可能为DHA作用的药理机制。

综上所述，DHA能够减轻COPD模型大鼠气道炎性反应和肺组织损伤，可能与抑制IL-6/STAT3信号通路有关。希望本研究能够为DHA成为有前景的治疗COPD的新药提供依据与支持。