膳食纤维在婴幼儿配方奶粉中的应用及检测方法研究进展

吴裕健，张栋，明双喜，张红霞，刘伟，杨颖

1. 山东省食品药品检验研究院（济南 250101）；

2. 山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心（济南 250101）

膳食纤维（Dietary Fiber，DF）是一种包含纤维素、半纤维素、木质素、果胶及可溶性多糖等多种成分的混合物，被称为继碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和水之后的“第七大营养素”[1]，具有零能量、防治肥胖、延缓和阻碍葡萄糖在体内的吸收、降低血清胆固醇、促进肠道有益菌的生长、抑制发酵有毒产物、通便润肠、防治肠癌等生理功能[2]。按溶解性，膳食纤维可分为水溶性（SDF）和水不溶性（IDF）两种，SDF和IDF的生理功能不同，SDF的持水力高、发酵作用较好，具有降低血脂、促进消化道的消化吸收等作用，而IDF可以增加粪便的含水量和体积，促进排泄[3]。对婴幼儿来说，母乳中营养物质非常丰富，其中富含的母乳低聚糖（Human milk oligosaccharide，HMOs）起到了维持肠道菌群的平衡，防止便秘以及促进肠道营养素吸收的作用[4]。然而，受多种因素的影响，我国纯母乳喂养的婴儿只占总数的27%[5]，因此，婴幼儿配方奶粉就成为必不可少的母乳替代品，为了模拟母乳中的各种营养成分，促进婴幼儿健康成长，婴幼儿配方奶粉生产过程中会添加一些营养素，并且添加具有母乳低聚糖生物功能的营养物质已成为重点研究方向之一。目前国产婴幼儿配方奶粉中通常添加低聚果糖（FOS）、低聚半乳糖（GOS）等膳食纤维来模拟母乳低聚糖的作用，基于此，文章对婴幼儿配方奶粉中的膳食纤维在国内的应用及检测方法进行论述，以期为婴幼儿配方奶粉中膳食纤维的进一步开发应用与检测提供参考。

1 膳食纤维在国产婴幼儿配方奶粉中的应用

HMOs的最高浓度出现在初乳中，为20～23 g/L，然后下降到成熟奶至12～14 g/L[6]，HMOs组分极其复杂，迄今为止，已发现200种HMOs，分离和鉴定了至少157种不同的HMOs结构[7]。动物乳低聚糖不具有HMOs的多样性，且多数哺乳动物乳低聚糖属于酸性低聚糖，中性低聚糖含量较少，与HMOs刚好相反，因此很难从动物乳中大规模获取与母乳成分类似的低聚糖[8]，寻找适合婴儿生长发育的非乳源低聚糖一直以来为人们所重视。国外婴儿配方乳粉中通常会加入乳酮糖来模拟HMOs，用以促进双歧杆菌增殖。国内关于乳酮糖在乳粉中的应用还比较少，主要是在婴幼儿配方乳粉中加入水溶性膳食纤维如低聚果糖、低聚半乳糖等，用以模拟HMOs分子大小分布[9]及调节肠道菌群、促进排便、提高免疫、减少感染、缓解过敏及特应性皮炎的作用[10]。GB 14880—2012《食品营养强化剂使用标准》[11]（以下简称GB 14880）表C.2中规定可在婴幼儿配方奶粉中添加的膳食纤维共5种，包括低聚果糖（菊苣来源）（FOS）、低聚半乳糖（乳糖来源）（GOS）、多聚果糖（菊苣来源）、棉子糖（甜菜来源）和聚葡萄糖，前四种要求单独或混合使用，该类物质总量不超过64.5 g/kg，而聚葡萄糖要求15.6～31.25 g/kg。文章收集不同品牌不同配方的国产婴幼儿配方奶粉198批次作为研究对象，共涵盖66个品牌的婴儿、较大婴儿和幼儿配方奶粉，地区覆盖我国山东、陕西、黑龙江等16个省，通过研究标签发现，198批次中共有159批次添加了膳食纤维，其中无添加的产品仅占19.5%，GOS和FOS的组合添加占比50%，位列第一，其次是单独FOS添加，占比18%，单独添加多聚果糖、聚葡萄糖都较少，占比1.5%，棉子糖在成品中均未添加（见表1）。从表1中可以看出，膳食纤维的总添加量低于GB 14880的要求或在GB 14880要求的下限，但接近于HMOs的含量，企业在生产中均最大限度模拟HMOs功能，但HMOs功能复杂，添加多少能真正起到模拟母乳低聚糖的作用尚值得探讨。

表1 婴幼儿配方奶粉膳食纤维的添加情况

2 我国婴幼儿配方奶粉中膳食纤维的国标检测方法

目前，我国检测膳食纤维的标准主要有GB 5009.88—2014[12]和GB/T 22224—2008[13]，以上两种方法均不能测定低聚糖的含量。若单一添加低聚果糖、多聚果糖，采用GB 5009.255—2016[14]。添加聚葡萄糖，采用GB 5009.245—2016[15]。添加低聚半乳糖目前没有相应的国家标准，每个检测机构采用各自内部方法进行检验，因企业未添加棉子糖文章未讨论。

2.1 国标中总膳食纤维的测定

2.1.1 GB 5009.88—2014[12]

GB 5009.88—2014适用于所有植物性食品及其制品中总的（TDF）、可溶性（SDF）和不溶性（IDF）膳食纤维的测定，但不包括低聚果糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖、抗性麦芽糊精、抗性淀粉等膳食纤维组分，原理是用酶解消化的方法去除蛋白质和可消化的淀粉。TDF是先将样品分别加入三种不同的酶进行酶解，并加入乙醇沉淀1 h，再抽滤得到残渣，分别用乙醇和丙酮洗涤残渣，烘干称重。IDF和SDF则是样品酶解后抽滤得到滤液和残渣，经热水冲洗残渣，干燥称重得IDF，滤液用乙醇沉淀后抽滤洗涤干燥称重校正得SDF，这三种含量的校正是通过蛋白质质量、灰分质量和试剂空白来进行的，该方法对添加了低聚糖的婴幼儿配方奶粉不能进行有效的全面检测。2021年7月15日，国家卫生健康委员会委托中国疾病预防控制中心营养与健康所和北京市营养源研究所对GB 5009.88—2014[12]的修订通过了专家审查，此次修订对现行方法中酶重量法的试样前处理条件进行了调整，调整了酶解体系，将标准适用范围扩大到植物性食品及其制品以及添加了膳食纤维组分的各类食品的测定，并增加了酶重量-液相色谱法，使方法尽可能覆盖符合膳食纤维定义及允许添加的组分，弥补了现行标准检测方法适用基质范围窄、检测组分种类少的不足。

2.1.2 GB/T 22224—2008[13]

GB/T 22224—2008中第二法酶重量法-液相色谱法有效，第一法已被GB 5009.88替代，该方法仅适用于含有抗性麦芽糊精的食品中总膳食纤维的测定。原理是先采用酶重量法测定IDF和高分子质量SDF的总含量，然后用高效液相色谱法测定试样中的低分子质量抗性麦芽糊精的含量，最后加和计算出总膳食纤维的含量，与其他方法相比，该方法需要更长的时间，同时对实验技能和设备的要求也更高，但酶重量法-液相色谱法较酶重量法具有较好的重现性。

2.2 国标中单一添加低聚果糖、多聚果糖、聚葡萄糖的检测方法

2.2.1 GB 5009.255—2016[14]

GB 5009.255—2016明确规定适用于单一添加低聚果糖、多聚果糖的产品的检测。原理是试样经热水浸提，样液中的蔗糖经蔗糖酶水解成葡萄糖和果糖，加入硼氢化钠溶液，将相应的糖醇还原，预估果聚糖含量后加入果聚糖酶使之水解成果糖和葡萄糖，用离子色谱-脉冲安培检测器检测果糖质量浓度，通过校正系数折算得到果聚糖的含量。该方法能准确测定配方乳粉中低聚果糖的含量，但也有前处理复杂、耗时较长等缺点。另外，果聚糖水解产物都是果糖和葡萄糖，对于非单一添加的果聚糖，由于无法估量平均聚合度，因此该方法不适用。

2.2.2 GB 5009.245—2016[15]

GB 5009.245—2016适用于添加聚葡萄糖的产品的检测。原理是食品中聚葡萄糖经热水浸提、超滤离心后，滤液经酶解去除淀粉、果聚糖等干扰物后，再用离子色谱-脉冲安培检测器定量测定聚葡萄糖含量。由于检测方法使用的检测条件和标准品单一，测定结果与实际添加量存在一定差异。

3 膳食纤维检测方法的研究进展

目前对于婴幼儿配方奶粉中允许添加的膳食纤维还缺乏部分检验方法，为了保障婴幼儿的健康，国家卫生健康委员会制修订并发布了3项婴幼儿配方食品标准，包含GB 10765—2021[16]、GB 10766—2021[17]和GB 10767—2021[18]，其中明确规定膳食纤维的含量可按低聚糖和（或）多聚糖的添加量计算，近年来国内外对于单一添加或组合添加低聚糖、多聚糖的检测方法的研究也在不断地深入，主要有分光光度法[19]、高效液相色谱法（HPLC法）[20,22-26]、离子色谱法（IC法）[27-30]和高效液相色谱串联质谱法（LC-MS法）[31-33]。文章结合近年研究动态，比较膳食纤维测定各方法的特点，以期为开发出适用性更强、效率及精准度更高的膳食纤维检测方法提供参考依据。

3.1 分光光度法

3.1.1 酶-分光光度法

AOAC 999.03[19]分别采用蔗糖酶、果聚糖酶水解蔗糖和果聚糖，用分光光度法测得水解产物果糖含量，通过折算系数计算得到果聚糖的含量。由于计算过程中采用的折算系数，没有考虑到果聚糖的不同化学结构形式，检测结果有时准确有时偏低。

3.2 高效液相色谱法（HPLC法）

3.2.1 高效液相色谱-示差检测法（HPLC-示差检测法）

邓伟恒等[20]以 GB/T 23528—2009《低聚果糖》[21]为基础，通过前处理通过等量加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液除去样品中的蛋白质、脂肪等物质，获得澄清溶液，以乙腈/水（75∶25，V/V）为流动相等度洗脱，利用氨基柱分离，示差检测器检测，测定低聚果糖的具体组分蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）。该方法前处理简单快捷、定量准确，但示差检测器不能进行梯度洗脱，灵敏度低，对于测定含量在1 g/100 g以下的样品时，结果偏差较大。

3.2.2 高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-蒸发光散射检测法）

张书芬等[22]通过对样品进行酶解法前处理，采用ZORBAX Carbohydrate糖分析专用柱、乙腈-水（85∶15）为流动相、雾化气流量1.6 mL/min的优化条件，建立了一种HPLC-蒸发光散射检测法测定低聚果糖的方法，该方法回收率为86.7%～105.1%，相对标准偏差小于5%，使用的仪器设备价格低廉、属于实验室基本配置，因此有较大的实际应用和推广价值。

张丽等[23]建立了一种检测乳粉中低聚果糖和低聚半乳糖的HPLC-蒸发光散射检测法，方法采用水和乙腈为流动相梯度洗脱，糖柱分离后蒸发光散射检测器检测，经过优化，确认最佳试验条件：乙腈为沉淀剂，酶解pH 6.0，酶解温度25 ℃，酶解时间 50 min。该方法回收率为92.52%～106.00%，相对标准偏差小于5.12%。该方法前处理未对乳糖进行预处理，当样品乳糖含量较高时，酶解产生的半乳糖也较高，对低聚半乳糖的结果会产生较大的影响，所以该检测方法要求乳粉中的乳糖含量不能过高，适用于乳糖和低聚半乳糖的含量比值小于8的样品中低聚果糖和低聚半乳糖的检测。

Zhang等[24]建立了HPLC-蒸发光散射法测定婴儿奶粉中的低聚半乳糖的方法，该方法采用酰胺柱，以乙腈与水（83∶17，V/V）为流动相，通过减少进样量，差向异构体峰分辨率优化，将GOS的峰分辨率从4.0提高到8.0，GOS的线性关系几乎不受葡萄糖含量高的影响。该方法具有良好的线性和稳定性，回收率为90.5%～105.1%，相对标准偏差为3.72%～5.81%，该方法灵敏度高、准确度高、样品制备方便，消除复杂基质干扰，解决了样品中高乳糖的干扰，符合婴儿配方奶粉中高GOS含量定量分析的法定限值要求。

3.2.3 高效液相色谱荧光检测法（HPLC-荧光检测法）

林慧等[25]建立了一种柱前衍生HPLC-荧光检测法测定低聚半乳糖含量的分析方法。样品用2-氨基苯甲酰胺衍生后，经色谱柱分离，用髙效液相色谱-荧光检测器检测，外标峰加和分段法定量。方法回收率为85.9%～103.5%，相对标准偏差小于5%，解决了婴幼儿配方乳粉中高含量乳糖对低聚半乳糖测定的干扰问题。

Cuany等[26]建立了一种HPLC-荧光检测法测定婴配中GOS的方法，该方法取稀释样品的两等分试样，一份用淀粉葡萄糖苷酶处理，以水解试样中所有的麦芽低聚糖，另一份用β-半乳糖苷酶处理，以水解试样中所有的GOS，将内标物（昆布三糖）添加到两份等分试样中，并用2-氨基苯甲酰胺荧光标记低聚糖，用乙腈中的甲酸铵水溶液梯度分离分析物，用高效液相色谱-荧光检测器检测，两次测量之间测定的低聚糖的差值即是样品的GOS含量。该方法回收率为91.5%～102%，相对标准偏差为0.7%～5.99%，适用于高乳糖含量的婴配产品。

3.3 离子色谱法（IC法）

白靖等[27]建立了果糖酶水解后采用IC法测定乳粉中多聚果糖的方法，缓冲盐体系优选醋酸缓冲液，加入果聚酶，酶解温度选定60 ℃，酶解时间优化至1 h，使多聚果糖全部酶解为果糖，然后用IC法分别测定样品酶解前后果糖及蔗糖的含量，计算得到多聚果糖的含量，对含麦芽糊精的样品需加入葡聚酶水解成葡萄糖，解决滤液浑浊和过滤不畅的问题，方法平均回收率为97.4%，相对标准偏差3.56%。该方法样品前处理简单、重复性好、灵敏度高。

朱伟等[28]建立了一种同时测定婴幼儿配方乳粉中低聚果糖、低聚半乳糖的IC法检测技术，优选CarboPac PA20色谱柱分离，采用氢氧化钠和乙酸钠溶液进行梯度洗脱。该方法功能性低聚糖能得到很好分离，回收率为80.0%～103%，相对标准偏差小于3%。

冉丹等[29]建立以电化学脉冲安培-IC法检测婴幼儿配方乳粉中低聚半乳糖含量的方法。采用离子色谱法检测经β-半乳糖苷酶酶解的原料糖浆试样中低聚半乳糖含量，再以测得低聚半乳糖含量的同批次原料糖浆作为对照，检测婴幼儿配方乳粉中低聚半乳糖含量。该方法线性关系良好，准确度较高，加标回收率为87.7%～92.4%，SRSD为3.5%，为高乳糖含量产品中GOS检测提供了新思路。

张志国等[30]建立了指纹图谱法测定婴幼儿配方乳粉中低聚半乳糖含量的方法，利用离子色谱构建低聚半乳糖指纹图谱，分析得到特征组分，进而测定婴幼儿配方乳粉中低聚半乳糖含量，该方法回收率为94.0%～106.7%，相对标准偏差1.2%～2.8%。样品前处理简便快速，定量准确，重现性良好，不需购买复杂的标准样品，解决了不同企业生产的低聚半乳糖组分复杂不易检测的技术难题。

3.4 高效液相色谱串联质谱法（LC-MS法）

甄振鹏等[31]建立了乳粉中低聚果糖的LC-MS检测方法，乙醇与水以7∶3的比例提取净化样品，离心移取上清液，采用XBridge Amide色谱柱，二级串联质谱检测器，负离子模式进行检测，该方法前处理简单、快速，灵敏度、准确度高。

刘芸等[32]建立了LC-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定奶粉中低聚果糖的方法，乳粉样品用水溶解后，加乙酸锌沉淀蛋白，离心过滤后，采用Carbohyduate色谱柱进行分离，以乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，正离子扫描模式，该方法前处理过程简便，分析时间短，能很好排除样品中的基质干扰，测定结果准确。

甄振鹏等[33]还建立了LC-MS法测定乳粉中的低聚半乳糖，同样采用XBridge Amide色谱柱，流动相采用乙腈水溶液进行洗脱，电喷雾质谱负离子模式，多反应监测（MRM）检测，该方法灵敏度高、定量准确，可以实现批量化检测，能有效提高工作效率、降低分析成本。

4 结语

膳食纤维在我国婴幼儿配方奶粉的应用尚在探索中，企业在生产中均最大限度模拟HMOs功能，但HMOs功能复杂，国内外研究还不完善，HMOs结构及组成、功能替代营养源以及膳食纤维的添加种类、添加量、添加方式等都需进行深入研究。随着研究成果的不断积累，建议在今后标准修订中及时补充婴幼儿配方奶粉中膳食纤维的添加种类、添加量等相关参数，方便指导和改进婴幼儿配方奶粉的生产。目前膳食纤维的国标检测方法的修订工作已审查通过，正处在向社会征求意见阶段，修订稿调整了酶解体系，并增加了酶重量-液相色谱法，弥补了现行标准检测方法适用基质范围窄、检测组分种类少的不足。相信随着研究的深入发展和新国标的发布实施，膳食纤维在婴幼儿配方奶粉的生产中应用和检测技术能得到更高效、更完善的发展，从而进一步促进婴幼儿配方奶粉产业的高质量发展。