基于全基因组信息的常山胡柚遗传鉴定

毛桑隐　汪丽霞　宋剑锋　刘胜军　王沦　徐强

关键词：常山胡柚；酸橙；基因组分析；分子标记；果实品质

中图分类号：S666.3 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2023）01-0025-10

常山胡柚（Citrus aurantium'Changshan Hu you）也叫常山柚橙、金柚、衢枳壳，是我国地方特色柑橘资源，主产区为浙江省衢州市常山县。据资料记载，常山胡柚已有上百年的栽培历史，最早在常山县青石镇底铺村和澄潭村栽培。目前，青石镇澄潭村胡家自然村还保存一棵树龄超过百年的实生胡柚树，如今栽培的常山胡柚大多源自这棵常山胡柚“祖宗树”。常山胡柚现已成为常山县特色农业支柱产业，是当地果农的重要收入来源。

有关常山胡柚的遗传背景，前人有不少研究。蒋柏宏通过分析胡柚的植物学性状，推测常山胡柚可能是柚和其他柑橘属的天然杂交种。蔡剑华等通过过氧化物同工酶酶谱法分析，发现常山胡柚有7条过氧化物同工酶酶谱带，而柚的5条酶谱带与常山胡柚其中5条完全一致，多余的2条正好与甜橙相吻合，表明常山胡柚可能是柚和甜橙杂交而来。陈力耕等利用RAPD分子标记技术对常山胡柚、桠柑、甜橙、衢橘和柚进行分子鉴定，推测常山胡柚可能是先由柚与桠柑或衢橘自然杂交，再与甜橙自然杂交而得到的天然杂种。陈士超等采用RAPD和ISSR分子标记技术对常山胡柚和常山当地柑橘资源进行鉴定，结果表明常山胡柚可能是由柚、甜橙和其他柑橘属资源通过多重杂交而来。Xu等通过对常山胡柚的可能亲本材料进行ITS序列分析，发现常山胡柚有2个不同序列的ITS1，其中ITSIA序列与柚完全一致，ITSIB序列与酸橙完全一致，推测常山胡柚是由柚与酸橙杂交而来。上述通过不同手段对常山胡柚的遗传背景进行了研究报道，然而对其遗传上的鉴定却报道较少。

随着现代测序技术的迅速发展，通过全基因组信息可以全面而准确地鉴定材料之间的变异。Xu等完成对二倍体甜橙的测序组装，揭示了二倍体甜橙是柚与橘杂交2次产生的杂种后代。Wu等完成对克里曼丁橘的测序，揭示了柑橘的驯化史和柑橘起源。前人完成了高质量柚、野橘、甜橙以及野生柑橘资源的基因组测序，为进行资源鉴定提供了丰富的基因组信息。

研究基于全基因组重測序信息，结合分子标记与橘、酸橙、葡萄柚、柚形态特征和品质性状对常山胡柚进行遗传鉴定，结果显示常山胡柚全基因组具有酸橙遗传背景，形态学特征与酸橙相似，果实品质较酸橙有明显改良，推测是一种品质改良的酸橙。可为进一步对常山胡柚的遗传背景分析和种质资源的保护利用提供理论依据。

1材料和方法

1.1试验材料

常山胡柚于2020年7月采样自浙江省衢州市常山县青石镇澄潭村。其他供试材料包括典型的柑橘资源与浙江地区的地方性橘、柚和酸橙等柑橘资源，具体详见表1。

1.2形态学观测

比较橘、酸橙、常山胡柚、葡萄柚和柚叶片与果实形态学上的差异。选择发育正常树体的中上部枝条，取完整的成熟叶片进行拍照比较，利用游标卡尺测量叶片长度和宽度，并计算叶形指数，记录翼叶，通过IBM SPSS Statistics 20软件用于显著性差异分析。同样在果实成熟期选择完整果实进行拍照，比较不同柑橘类果实正面与果实切面。

1.3果实品质测定

选取橘、酸橙、常山胡柚、葡萄柚和柚的成熟果实进行品质测定，通过游标卡尺测量果实横径、纵径，并计算果形指数；采用电子天平测定果实单果质量、果皮质量、果渣质量、种子质量等指标，并计算可食率；采用手持糖酸仪测定可溶性固形物和可滴定酸，计算果实固酸比；2，6-二氯酚靛酚试剂测定抗坏血酸含量。最后通过IBM SPSS Statistics 20软件用于显著性差异分析。

1.4全基因组重测序分析

取常山胡柚新鲜叶片于研钵中使用液氮对其进行充分研磨，将研磨好的冻样送测序公司（北京诺禾致源科技股份有限公司）进行全基因组重测序，测序深度25.7层，共获得17.5G数据量。以甜橙作为参考基因组，通过BWA软件将重测序数据比对到甜橙参考基因组，使用gatk4.0进行SNP-calling，最终获得常山胡柚与橘、酸橙、葡萄柚和柚的SNP数据。利用本实验室前期已获得的可区分柑橘几大基本种的诊断型SNP位点，对常山胡柚与橘、酸橙、葡萄柚和柚基因组以200kb为窗口、100kb为步长进行滑动，将全基因组划分为3390个区域，并对每一个窗口内的SNP信息进行统计分析用以判断每个窗口的遗传来源，获得各自全基因组的遗传成分图，并基于群体重测序鉴定到的高质量SNP及甜橙基因组鉴定到的4dTV位点，最终使用131387个4dTV位点构建聚类树。

1.5 DNA提取及InDel分子标记开发

通过CTAB法对柑橘叶片进行DNA提取。利用SNP-calling后的InDel数据寻找橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚基因组差异信息，开发特异性In-Del分子标记，经过多对引物筛选确定了4对InDel引物可用于验证橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚之间的遗传差异（由武汉擎科生物公司合成），其InDel变异位点位于2号染色体和7号染色体上不同位点，引物序列详见表2。PCR扩增使用高保真酶（Phan-to Max Super-Fidelity DNA Polymerase）进行，反应体系为20μL，各组分为2×phanta Max Buffer 10μL，Phanta Max 0.4μL，dNTP Mix 0.4μL，Forward prim-er 0.5μL，Reverse primer 0.5μL，DNA原液1μL（150 ng左右），ddH20 7.2μL。在Tl00 Thermal Cy-cler型号PCR仪中进行扩增，PCR扩增反应条件为预变性95℃3 min，变性95℃15 s，退火54℃15 s，延伸72℃40 s，35个循环，终延伸72℃5 min。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳检测条件为恒定电压120 V、电流400 mA、额定功率100 W，电泳20 min，之后在Universal Hood II仪器中检测PCR产物。

2结果与分析

2.1叶、果形态学分析

通过对本地早橘、秭归酸橙、常山胡柚、星路比葡萄柚和四季柚的叶片和果实进行观察（图1），不同柑橘资源的叶形差异较大，常山胡柚的叶片形态与酸橙相近，接近卵圆形或卵形，且翼叶较小，而柚翼叶较大。常山胡柚属于中小果型，大小与酸橙相似，果皮金黄色，果肉呈淡黄色，果皮厚度与酸橙相近。另从叶形指数可以看出常山胡柚与秭归酸橙差异不显著，而与本地早橘、星路比葡萄柚和四季柚差异显著（表3）。

2.2不同柑橘资源常规品质分析

选取本地早橘、秭归酸橙、星路比葡萄柚和琯溪蜜柚等典型柑橘品种与常山胡柚进行果实品质分析。由表4可知，不同柑橘种类的内外品质存在差异，常山胡柚在单果质量、果皮厚度、种子质量和果皮质量等外观品质指标上与酸橙无显著差异，与橘、葡萄柚和柚存在显著差异。而常山胡柚在可滴定酸和固酸比等内在品质指标上与酸橙存在显著差异，其可滴定酸平均含量为0.98%，固酸比平均可达12.30，相较酸橙而言内在品质有明显改良。

2.3胡柚全基因组分析

通过分析全基因组重测序数据，利用本实验室前期开发的柑橘基因组数据库，鉴定橘、常山胡柚、酸橙、葡萄柚和柚的遗传组成，结果显示常山胡柚全基因组超过87.91%的遗传组分为柚橘杂合，柚纯合的遗传组分占9.77%（图2）。通过与其他供试柑橘材料的全基因组结构进行比较，发现常山胡柚与酸橙的基因组结构最为相似（图3），其中与江津酸橙的基因组结构相似度最高，达到了88.34%。通过常山胡柚与其他柑橘材料进行聚类，显示常山胡柚与酸橙聚类在一起（图4），综上表明常山胡柚是一种酸橙。

2.4分子标记验证

通过前期分子标记的开发，在全基因组不同变异位点上筛选到4对InDel引物可用于鉴定橘、柚、常山胡柚、酸橙与葡萄柚之间的遗传差异。结果如图5所示，橘为1条长带，柚和葡萄柚为1条短带，酸橙为柚和橘的2条带，常山胡柚扩增的条带大小与酸橙条带相符，为柚和橘的2条带，与柚和葡萄柚不符，故推测常山胡柚的亲缘关系与酸橙相近。

3讨论

笔者在本研究中基于全基因组重测序技术，结合形态学与果实品质分析，发现常山胡柚全基因组信息表现为酸橙的特征，叶形态和果实大小与酸橙相似，分子标记也印证与酸橙亲缘关系较近，表明常山胡柚是一种酸橙，且常山胡柚果实品质优于普通酸橙，其可滴定酸含量显著低于酸橙，是一种品质得到改良的酸橙，推测其在栽培过程中逐渐驯化为一种低酸类型的酸橙。

近年来，随着测序技术的快速发展，全基因组序列为进一步探索物种进化和资源鉴定提供了更为全面的信息。笔者通过分析全基因组重测序数据，发现常山胡柚超过87.91%的遗传组分为柚橘杂合成分，且常山胡柚的全基因组序列与酸橙的相似度较高，最高可达88.34%，聚类分析显示常山胡柚与酸橙聚类在一起，表明常山胡柚是一种酸橙，符合常山胡柚ITSIB序列与酸橙完全一致的报道。而对于酸橙的亲本，目前普遍认为酸橙是柚与宽皮橘的F₁代后代，且柚很可能是母本。该观点从同工酶、细胞学以及分子标记等多个方面得到证实。相关研究也验证了酸橙起源的模式，何发通过SSR分子标记验证酸橙起源模式为柚×橘，Wu等从多份柑橘属资源的全基因组数据进行分析证实了酸橙的亲本为柚和宽皮橘。常山胡柚作为一种酸橙，推测其亲本为柚和橘，与前人报道常山胡柚的起源过程中柚和宽皮柑橘可能是主要的起源亲本相吻合。

分子标记技术自20世纪80年代开始广泛应用，也常常应用于果树种质资源鉴定与遗传分类。InDel标记作为一种新型分子標记，适用于分析近缘物种间的基因组上同一位点序列插入和缺失的差异，且InDel标记开发成本较低、准确性高、多态性强和检测简便，因此受到广泛认可和应用。本研究对橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚基因组重测序数据进行筛选，开发特异性InDel分子标记进一步印证常山胡柚的亲缘关系与酸橙相近，而非柚与葡萄柚。此外，在今后的研究中，也有望通过InDel标记应用于常山胡柚的精准育种中，为育种实践提供理论依据。

枳壳作为常用的大宗药材，如湘枳壳、川枳壳、江枳壳等都是传统中药材，其次生代谢物常用于药理研究，大部分地区标准均收载酸橙及其栽培变种作为枳壳的基原植物，如新疆、云南、香港等。常山胡柚未成熟果实可直接入药，自2016年以“衢枳壳”载入《浙江省中药炮制规范》后命名为衢枳壳，正式成为一味中药材，表明常山胡柚为酸橙或酸橙的栽培种，与本研究鉴定常山胡柚是一种酸橙的结论相符，另本研究也可为常山胡柚用于中药材开发与应用提供遗传依据。

4结论

通过对常山胡柚进行形态学、果实品质、基因组重测序分析与InDel分子标记验证，初步明确常山胡柚为酸橙遗传背景，推测是经长期栽培驯化后形成的一种果实品质改良的酸橙。这对柑橘资源的分类鉴定提供参考，为进一步探究常山胡柚的遗传起源进化提供依据，同时开发的InDel标记也有望应用于柑橘育种材料鉴定，为育种实践提供理论依据。