高通量测序技术在唐氏筛查临界风险非高龄孕妇中的应用研究*

郭 刚 王丽芳 王康英

莆田学院附属医院，福建省莆田市 351100

我国是出生缺陷高发国家，数据显示染色体异常作为重要的遗传缺陷，可能会影响1/200～1/150的新生儿[1]。目前尚无治疗染色体疾病的有效方法，因此作为二级预防的产前筛查和产前诊断显得尤为关键。胎儿染色体非整倍体异常在出生缺陷儿中的发病率较高，准确筛查及诊断是临床迫其需求的，目前临床应用最为广泛的是血清学筛查，但筛查准确性不可靠，漏诊率高[2]，而介入性产前诊断，容易引起孕妇焦虑和恐惧，并有导致流产和宫内感染的风险[3]。无创产前基因检测(NIPT)技术仅需采取孕妇静脉血，利用高通量测序技术对母体外周血浆中的游离胎儿DNA片段进行测序，进行生物信息分析，从中得到胎儿染色体非整倍体信息[4-5]。NIPT已经成为一种新的筛查技术。本研究对2 464例血清学筛查临界风险自愿进行NIPT的孕妇进行研究，结合介入性产前诊断的结果，分析NIPT对唐氏筛查临界风险者的应用价值。

1 资料和方法

1.1 背景资料 选取2017—2019年间在我院血清学筛查临界风险且进入无创DNA产前检测的2 464例孕妇为研究对象。纳入标准：(1)自愿NIPT；(2)1年内没有异体输血、细胞治疗等；(3)夫妻双方无明确染色体异常；(4)超声单胎；(5)预产年龄<35周岁；(6)体重指数<40等。对选择NIPT的孕妇应充分告诉该方法的适应证、局限性等，并签署知情同意书，对结果高风险者建议做介入性产前诊断，对纳入对象随访其妊娠结局及产后胎儿情况。

1.2 方法

1.2.1 中孕唐氏筛查：空腹状态下抽取孕妇静脉血2～3ml于空白管，离心尽快分离血清并及时检测，未及时检测的标本需低温保存。中孕期唐氏筛查采用血清学三联筛查即AFP+ Free-βhCG+uE3。仪器为芬兰PerkinElmer公司提供的DELFLA 1 235型号，试剂为其配套试剂盒。根据检测值再结合孕妇孕产年龄、孕周、体重等利用分析软件给出该孕妇怀染色体非整倍体胎儿的风险率。唐氏筛查临界风险截断标准：21-三体为1/1 000～1/271；18-三体为1/1 000～1/351。

1.2.2 无创基因产前检测(NIPT)：抽取孕妇外周血10ml于康健游离核酸保存采血管(CFDNA)后，立刻颠倒混匀，常温8～30℃保存，并于当日送往福州博奥生物集团有限公司。测序仪器为基因测序仪BES4000，分析软件为无创产前数据分析管理系统V3.0。通过高通量基因测序检测孕妇外周血胎儿游离DNA并进行生物信息分析。NIPT正常范围为-3.0

1.2.3 染色体核型分析：对NIPT异常结果经临床医生咨询后自愿选择介入性产前诊断的孕妇，在超声的引导下经腹行羊膜腔穿刺，抽取25ml，送实验室培养、收获、固定、G显带等，计数2个独立培养瓶的40个细胞，分析20个细胞，分辨率达320～400条带水平。以人类细胞遗传学命名的国际体制(ISCN)2016作为核型分析的标准。

1.3 后续追踪和随访 对NIPT低风险的孕妇后续追踪其彩超情况并随访其妊娠结局及新生儿情况，NIPT高风险孕妇建议进入产前诊断，关注其诊断结果并随访妊娠结局，对拒绝介入性产前诊断的应随访其妊娠结局及产后新生儿表现。

2 结果

本文通过研究2 464例唐氏筛查临界风险自愿行NIPT的孕中期孕妇，结果为NIPT提示高风险24例，筛查阳性率为0.97%(24/2 464)。其中6例21-三体(T21)高风险，5例18-三体(T18)高风险，1例T18和T13共同高风险，7例性染色体异常，其他异常5例。对结果异常者的孕妇，电话通知至本院遗传咨询门诊，经咨询并同意选择介入性产前诊断的孕妇19例，核型分析结果11例异常(其中确诊4例21-三体，5例性染色体，其他核型异常2例)，核型正常8例。经分析NIPT的阳性预测值为57.89%(11/19)，具体见表1。

表1 24例NIPT高风险及核型分析结果

NIPT高风险拒绝介入性产前诊断的5例孕妇进行随访，其中3例18-三体高风险者因彩超提示多发畸形而选择直接引产，其他2例随访孕妇自述胎儿无明显形态异常。2 440例NIPT低风险随访至分娩后，其中59例随访不到，随访率97.58%，随访中发现3例流产，4例胎死宫内，7例不同程度彩超异常而引产，其余均未发现有明显染色体异常新生儿。

3 讨论

1997年，香港中文大学罗玉明教授首次证明孕妇外周血中有胎儿游离DNA，来源于胎盘，开辟了无创产前基因检测(NIPT)的新方法。迄今为止，它已在世界许多国家得到广泛应用[6]。无创产前基因检测采用新一代高通量测序技术，基于母体血浆检测游离胎儿DNA。经过生物信息学分析，检测出胎儿染色体异常，国内外研究表明NIPT具有无创、安全、快速、准确性和可靠性高等特点[7-8]。NIPT筛查具有一定的临床实用价值[9]。

目前临床常用的产前诊断模式是血清学筛查高风险建议进入介入性产前诊断，这种模式还是会导致30%～40%的缺陷儿漏诊[10]，为此有学者提出临界风险的定义，研究报道有一定比例的漏筛出现在血清学筛查临界风险的孕妇中[11]，因此对这部分人群的筛查很有必要的。且羊膜穿刺术有严格的适应证和禁忌证[12-13]这种方法可能会带来胎儿宫内感染和羊水漏出的风险，同时增加孕妇的心理压力，因此在孕妇中接受率不高。在一定程度上限制了临床应用。因此，寻求一种合理实用的产前筛查诊断方法，实现胎儿染色体疾病的准确检测，对于降低出生缺陷的发生率具有重要意义。

本文选取2017年1月—2019年12月在本院血清学筛查结果临界风险经咨询自愿选择NIPT的单胎非高龄孕妇为研究对象，筛查出24例NIPT高风险孕妇，21-三体6例，18-三体5例，性染色体异常7例，T18和T13共同高风险1例，其他异常5例。咨询建议行介入性产前诊断的19例，经核型及芯片结果确诊符合的有11例，21-三体4例，18-三体0例，性染色体异常5例，其他异常2例。本文研究了2 464例孕妇，其中NIPT低风险的孕妇中59例没有随访到。所以统计人数按2 405计。敏感性=真阳性病例数/(真阳性病例数+假阴性病例数)，特异性=真阴性病例数/(真阴性病例数+假阳性病例数)，阳性预测值=真阳性病例数/(真阳性病例数+假阳性病例数)，本研究中未出现假阴性病例。所以该方法对21-三体的敏感性为100%，特异性均为99.9%(2 403/2 405)，阳性预测值为66.67%(4/6)，性染色体的阳性预测值为71.43%(5/7)，而18-三体阳性预测值为0，可能因为数据不足和18-三体综合征的胎儿往往表现多种脏器畸形，孕妇直接选择引产。血清学临界风险者相对高风险者基数较大，对其均行介入性产前诊断是不可取的，随着技术的发展，2015年专家提出了NIPT可以应用于中风险人群的共识[14]。有研究表明，临界风险的孕妇中生育唐氏儿的风险为0.46%[13]，本文确诊4例21-三体，故唐氏儿的风险率为0.17%(4/2 405)的唐氏缺陷儿。目前国内外对NIPT应用于血清学筛查临界风险的单胎非高龄的报道较少，本研究表明对于唐氏筛查临界风险的单胎非高龄孕妇进行NIPT筛查是具有意义的，筛查阳性率为0.97%(24/2 464)。特殊病例讨论：本研究出现1例NIPT提示T21/Chr4+/Chr8+异常的孕妇最终核型发现是正常的，后续随访发现孕妇本身患有白血病，因为恶性肿瘤干扰胎儿游离DNA的检测，影响检测结果[15]。

综上所述，妊娠女性外周血胎儿游离DNA的高通量测序技术可用于临界风险妊娠女性胎儿染色体疾病的产前筛查，具有较高的敏感性和特异性。可以作为产前诊断的重要补充，可以降低血清学临界风险孕妇的穿刺率，降低出生缺陷的发生。但 NIPT 存在一定程度的假阳性，并且NIPT作为一种筛查技术，筛查异常者仍需结合传统的羊水细胞核型分析，以提高对胎儿染色体疾病的诊断效能。