硫氧还蛋白5在精索静脉曲张大鼠睾丸中的表达及意义*

程 隆 朱智荣 唐桂良

1 绍兴文理学院医学院，浙江省绍兴市 312000； 2 浙江大学绍兴医院

精索静脉曲张(Varicocele，VC)是指睾丸蔓状静脉丛迂曲扩张、伸长的一种病理现象。精索静脉曲张具有发病率高、早期不易发现等特点，是引起我国男性不育的常见疾病之一[1-3],但其具体机制尚未清楚。目前研究发现氧化应激(Oxidative stress，OS)可产生过量的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)直接破坏精子细胞，导致睾丸组织损伤[4]。硫氧还蛋白5 (Thioredoxin domain containingprotein 5，TXNDC5) 是近年来发现上皮PDI家族成员之一[5],其对缺氧的内皮细胞具有保护作用，可对抗VC发生发展过程中的氧化应激损伤[6-7]。这些研究对OS导致精索静脉曲张提供了一个崭新的思路。本研究通过构建左侧VC大鼠模型和精索静脉曲张高位结扎术后大鼠模型，旨在探究TXNDC5在OS导致睾丸组织损伤中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 30只7周龄雄性SD大鼠(体重约 200g)，购买于上海斯莱克实验动物中心。所有动物饲养在恒定的温度[(22±2)℃], 自由进食、进水。本实验所有动物均获得伦理学批准。

1.2 动物分组及模型制备 将30只大鼠按照随机数字表法平均分入假手术组、模型组和治疗组。假手术组：仅游离左精索静脉而不进行缩窄和结扎。模型组：根据Turner法使左肾静脉部分狭窄。8周后再次进入大鼠腹腔，在麻醉后显微镜下测量左精索静脉直径扩张>1mm作为纳入精索静脉曲张大鼠模型组的标准。治疗组：在模型组建立成功的基础上，术后8周在显微镜下游离并结扎左精索静脉，术后继续饲养4周。

1.3 标本采集 8周时假手术组和模型组大鼠取下左侧睾丸，切分两部分，一部分冻存-80℃冰箱备用，一部分浸泡于福尔马林。治疗组大鼠在静脉结扎术后再饲养4周后进行与模型组和假手术组相同的操作留取冻存标本备用。通过HE染色观察睾丸的病理情况和免疫组化检测TXNDC5蛋白。

1.4 HE染色 通过4%多聚甲醛将三组大鼠睾丸组织固定24h后，常规石蜡包埋。将睾丸组织标本切成5μm厚的切片，再经过脱蜡, 水合，苏木精—依红染色后封片。采用光学显微镜(NIKON公司)进行图像采集。

1.5 免疫组化 将4%多聚甲醛固定且石蜡包埋后的三组睾丸组织标本切成5μm厚的切片，再通过脱蜡，水合，在3%H2O2中高压修复15min。切片用PBS 冲洗3次，在玻片的组织部位滴加TXNDC5一抗(proteintech，1∶100)置于湿盒中室温孵育2h。再次用PBS 冲洗3次，再滴加HRP标记光谱二抗，孵育30min。DAB染色后苏木精复染。再使用二甲苯反复两次冲洗染色好的玻片，中性树胶封片后，采用光学显微镜(NIKON公司)进行图像采集。显微镜下棕褐色为阳性染色。染色越深，反映细胞内蛋白表达量越高。

2 结果

2.1 各组大鼠睾丸组织形态观察 根据HE染色可以观察到，假手术组大鼠睾丸组织各曲细精管内生精细胞形态规则，层次清楚，结构正常。模型组大鼠睾丸组织病理损伤明显，各级生精小管排列错乱，生精细胞和精子细胞明显减少。治疗组大鼠睾丸组织病理损伤较轻，曲细精管层次轻度错乱，少量曲细精管内生精细胞减少。见图1。

图1 光镜下各实验组大鼠睾丸组织显微结构(HE×200)a.假手术组：睾丸生精细胞排列致密且完整 b.模型组：睾丸生精细胞排列错乱且数量减少 c.治疗组：睾丸生精细胞排列正常或轻度错乱

2.2 VC下调TXNDC5的表达 根据免疫组化实验(见图2)可见假手术组大鼠睾丸细胞染色最深，而模型组大鼠睾丸细胞染色最浅。由此说明假手术组大鼠睾丸组织内TXNDC5蛋白水平较模型组大鼠较高，但通过治疗大鼠睾丸组织内TXNDC5蛋白水平有一定的升高。即精索静脉曲张可导致大鼠睾丸内TXNDC5蛋白水平降低，但通过精索静脉高位结扎术可以上调一定的TXNDC5蛋白水平。

图2 免疫组化检测各实验组大鼠睾丸组织中TXNDC5的表达(HE×200)a.假手术组 b.模型组 c.治疗组

3 讨论

精索静脉曲张是引起我国男性不育最常见的疾病之一，其发生机制众多且未完全阐明[8]。其中氧化应激学说是指机体在受到损伤时处于氧化应激状态，过量产生的ROS会导致机体二次损伤。生理浓度的ROS有利于精子的生长发育，但精索静脉曲张时产生过多的ROS会导致抗氧化酶的平衡失调从而损伤精子[9-10]。过量的ROS会导致精子功能的损害。同时，受损伤的精子更容易受到ROS的攻击，从而导致恶性循环，使得精子损伤进一步加重[11]。本文构建大鼠VC动物模型，并研究精索静脉曲张高位结扎术对其治疗效果，结果显示与假手术组相比较，模型组大鼠睾丸组织受到明显病理损伤，睾丸组织形态排列错乱、生精细胞和精子细胞明显减少。而通过精索静脉高位结扎术后，可以一定程度扭转精索静脉曲张引起的病理损伤。由此说明VC大鼠存在一定程度的氧化应激损伤，而这种损伤存在一定的可逆性。

TXNDC5基因作为上皮PDI基因家族成员之一。其表达的TXNDC5蛋白在抗氧化作用中起到了重要的作用。在缺氧环境下过量产生的ROS会导致HIF-1α的表达增加，HIF-1α作为细胞缺氧的分子标志，可以保护细胞质免受蛋白酶体的降解，从而负反馈来抑制ROS的进程[11]。TXNDC5蛋白可以与HIF-1α结合并保持其稳定性从而起到抗氧化作用[12]。另外，通过对类风湿关节炎病人蛋白质样本的质谱分析，确定了TXNDC5在内源性抗氧化反应中有调节作用[13]。TXNDC5也被证实与ERpl8在细胞中共同调节氧化还原酶的活性，是氧化还原状态，Ca2+泵等的关键调节蛋白[13-14]。本实验结果显示，模型组TXNDC5蛋白水平较假手术组相比明显下调。说明TXNDC5蛋白水平表达失调可能是导致VC发生发展的一条病理通路。

本实验结果显示VC模型大鼠睾丸组织内可见明显的病理损伤。说明VC可产生超出机体承受范围的ROS，从而一定程度地损伤睾丸组织及其生精细胞。同时这些损伤可通过精索静脉高位结扎得到一定程度的扭转。另外，本实验结果亦显示VC模型大鼠TXNDC5蛋白水平下调，因此推测VC氧化应激是通过下调TXNDC5蛋白，从而使得大鼠睾丸组织抗氧化能力降低，从而受到一定程度的氧化应激损伤。即VC中ROS可以抑制TXNDC5蛋白表达，从而导致睾丸组织的损伤。但VC发生机制众多，本文通过研究TXNDC5表达诱导精索静脉曲张睾丸组织氧化应激损伤的分子机制，希望能为阐明VC发生机制以及评估VC手术指征与术后疗效提供一个新思路。