荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎软骨退变的作用机制

戴雨婷，郑若曦，王 鹤，陈 俊，陈振沅，吴广文

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；3.中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州 350122）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的退行性疾病，膝关节因其承载全身负重而最为多发［1-2］。膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的形成与人口老龄化、肥胖、不良生活习惯、错误运动方式、职业、外伤史、家族史等因素密切相关，在女性中更为多见，且发病群体出现年轻化趋势［3］。以软骨基质进行性丢失为典型表现的软骨退变是KOA发病的关键，软骨基质主要由以Ⅱ型胶原（CollagenⅡ）为主的各种胶原蛋白和以聚集蛋白聚糖（Aggrecan）为主的蛋白多糖构成［4-5］，因此有效调控CollagenⅡ与Aggrecan 的合成和分解代谢是延缓软骨退变的关键。研究发现长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）不但调控癌症等疾病的发生，而且在OA 相关细胞中的表达存在差异性，对延缓KOA 发病具有重要调节作用［6-7］；微小RNA（micro RNA，miRNA）可通过调控胶原蛋白表达影响软骨细胞的衰老与修复，这被认为是有效治疗OA 的新工具［8-9］。研究表明，LncRNA H19 通过调控miR-675 可促进参与合成软骨细胞相关蛋白的分泌，从而减缓KOA 进程［10］。荣筋拈痛方是挖掘陈可冀院士《清宫配方集成》基础上拟定而成，前期研究发现荣筋拈痛方可通过多靶点、多途径对KOA 大鼠起到一定的治疗作用［11］，但其是否可通过调控LncRNA H19/miR-675 治疗KOA 尚不明确。本研究构建KOA 模型，通过观察荣筋拈痛方对软骨组织中LncRNA H19/miR-675 及下游CollagenⅡ、Aggrecan 表达水平的影响，旨在探讨荣筋拈痛方延缓大鼠KOA 软骨退变的作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级8 周龄雄性SD 大鼠46 只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2007-0011。

1.2 实验药物 荣筋拈痛方颗粒剂由江阴天江药业有限公司生产（批号：2006001）；盐酸氨基葡萄糖胶囊由香港澳美制药公司生产（批号：4170135）。参照“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”［12］计算，大鼠给药量是成人的6 倍。按照大鼠灌胃量为10 mL/kg，将1 袋荣筋拈痛方颗粒剂溶解于0.9%生理盐水后定容至100 mL；将1 粒盐酸氨基葡萄糖胶囊溶解于0.9%生理盐水后定容至100 mL。

1.3 实验试剂 Trizol（美国Thermo Fisher 公司）；无水乙醇（美国Sigma 公司）；氯仿（西陇科学股份有限公司）；异丙醇（中国国药集团化学试剂公司）；Mir-XTMmiRNA 逆转录试剂盒、PrimeScriptTMRT mRNA 逆转录试剂盒、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ试剂盒（日本Takara 公司）；AceQqPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。

1.4 实验仪器 全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；NanoDrop 2000 超微量分光光度计（美国Thermo 公司）；PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；7500 Fast实时荧光定量基因扩增仪（美国ABI公司）。

2 方 法

2.1 分组与造模 46 只SD 大鼠适用性喂养1 周后，随机分为空白组（13 只）与造模组（33 只）。空白组进行假手术处理，将膝关节内侧切开1 cm 左右的皮肤与肌肉后随即缝合，不打开关节腔；造模组采用改良Hulth 法构建大鼠KOA 模型［13］，同时连续3 d 肌内注射20 万U 青霉素防止感染。造模2周后，随机选择2组中各3只大鼠拍摄膝关节MRI，鉴定造模是否成功。造模成功后，随机将造模组大鼠分为模型组、治疗组和对照组，每组各10 只。

2.2 药物干预 治疗组按1.9 g/（kg·d）予荣筋拈痛方颗粒药液灌胃，对照组按0.15 g/（kg·d）予盐酸氨基葡萄糖胶囊药液灌胃，空白组与模型组予等量0.9%生理盐水灌胃。每日灌胃2次，连续灌胃12周，每周称取1 次体质量调整灌胃量。

2.3 取材 连续干预12 周后，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，打开膝关节腔，剥离膝关节周围的肌肉、韧带等组织，分离右侧胫骨平台后迅速投入液氮中，随后放入-80 ℃冰箱保存。

2.4 Real-time PCR 法检测LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ、Aggrecan 基因表达水平

2.4.1 总RNA 提取 将各组右侧胫骨平台样本从-80 ℃冰箱取出，收集软骨组织并加入液氮研磨，采用Trizol 试剂盒提取各组总RNA，并于分光光度计检测总RNA 浓度。

2.4.2 miRNA 的逆转录与检测 配置miRNA 逆转录体系10 μL：mRQ Enzyme Mix 1.25 μL，mRQ Buffer（2×） 5 μL，1 μg 总RNA 与DEPC 水共3.75 μL。反应条件：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。以逆转录成的cDNA 为模板，配置Real-time PCR 反应体系。① U6 反应体系：Mix（2×） 5 μL，ROX（50×）0.2 μL，U6-F 0.4 μL，U6-R 0.4 μL，cDNA 2 μL，DEPC水2 μL。② miR-675反应体系：Mix（2×） 5 μL，ROX（50×） 0.2 μL，miR-675 引物0.4 μL，mRQ3” Primer 0.4 μL，cDNA 2 μL，DEPC 水2 μL。扩增反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火34 s，共40 个循环，最后95 ℃ 15 s，60 ℃延伸1 min。以U6 为内参，采用2-ΔΔCt法分析miR-675 相对表达水平，引物序列见表1。

2.4.3 LncRNA/mRNA的逆转录与检测 配置mRNA逆转录体系20 μL。① gDNA去除：gDNA Eraser 1 μL，gDNA Eraser Buffer （5×） 2 μL，1 μg总RNA与DEPC水共7 μL，离心后室温静置5 min。② Prime Script RT Enzyme MixⅠ1 μL，Prime Script Buffer （5×） 4 μL，RT Primer Mix 1 μL，DEPC 水4 μL。反应条件：37 ℃15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。以逆转录成的cDNA为模板，配置Real-time PCR 反应体系：Mix（2×） 10 μL，ROX（50×） 0.4 μL，各指标正向引物（F）与反向引物（R）各0.4 μL，cDNA 1 μL，DEPC 水7.8 μL。扩增反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火34 s，共40 个循环，最后95 ℃ 15 s，60 ℃延伸1 min。以β-actin 为内参，采用2-ΔΔCt法分析LncRNA H19、CollagenⅡ、Aggrecan 基因相对表达水平。引物序列见表1。

表1 PCR 相关扩增引物序列

2.5 统计学方法 运用SPSS 23.0 统计软件对数据进行统计学分析。计量资料符合正态分布采用（±s）表示。当满足正态分布时，运用单因素方差分析，若方差齐则运用LSD-t检验进行组间两两比较，若方差不齐则运用Games-Howell 检验进行组间两两比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 实验动物饲养情况 治疗组有2 只大鼠在灌胃过程中可能因肺栓塞死亡。

3.2 膝关节MRI 结果 空白组大鼠膝关节整体结构完整且无肿胀，内外侧半月板形态完好，关节腔间隙正常无积液，胫骨平台与股骨髁软骨的表面平整。造模组大鼠膝关节整体结构不完整，肿胀明显，内侧半月板缺失，关节腔间隙变宽且有积液累积，胫骨平台与股骨髁软骨的表面不平整，局部缺如，伴有结缔组织增生与骨赘形成，以上结果表明大鼠KOA 模型建立成功。见图1。

图1 大鼠膝关节MRI 影像图

3.3 4 组 大 鼠 软 骨 组 织LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ和Aggrecan 基因表达水平比较 与空白组比较，模型组软骨组织LncRNA H19、miR-675、Collagen Ⅱ和Aggrecan 基因水平均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组和对照组软骨组织LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ和Aggrecan 基因水平均明显升高（P＜0.05）。见图2。

图2 4 组大鼠软骨组织LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ和Aggrecan 基因水平比较

4 讨 论

KOA 临床常表现为疼痛、肿胀、僵硬、关节屈伸不利、活动受限等，严重者会致畸、致残，给患者和社会带来严重的经济损失与生活负担［14］。流行病学调查数据发现，40、60、80 岁以上人群患病率分别为38%、50%、80%［15-16］。局部使用非甾体类抗炎药为目前KOA 的一线治疗方法。与口服相比，关节腔内注射配合糖皮质激素治疗是临床常用的选择，疗效显著且副作用小［17］。但是非甾体类抗炎药的广泛使用存在患有心肌梗死的弊端，除此之外还存在胃肠道出血的毒副作用，具有一定程度的死亡率，严重危害患者的生命安全。手术治疗因其较高的手术置换费用、术后并发症、康复时间长等缺点不被晚期患者所采纳［18-20］。因此，KOA 的防治已然成为公共健康的重大课题，研发疗效明确，毒副作用少，能够缓解甚至阻断KOA 发展的新药具有重大意义。

KOA 归属于中医学“骨痹”范畴，骨痹实则为“虚证”“痿证”，治疗的关键为扶正祛邪［21］。荣筋拈痛方由牛膝、当归、独活、羌活、防风、甘草组成，具有补肝肾、壮筋骨、祛风湿、止痹痛之功效。牛膝、当归君臣相伍，补肝肾、壮筋骨，又兼活血，寓“治风先治血，血行风自灭”之意；独活治下，羌活治上，与防风共行祛风、除湿、止痛之效，三者皆为佐药；甘草缓急止痛，调和诸药为使药。荣筋拈痛方标本兼顾，对痹证日久、肝肾俱虚的膝骨关节炎具有治疗作用［22］。前期研究可知，荣筋拈痛方具有抗炎镇痛的效果，临床可有效缓解KOA 症状［23］。其有效成分可通过促进胶原蛋白与蛋白多糖的合成参与软骨基质的合成，降低基质金属蛋白酶的表达，参与软骨基质的分解，进一步利用促进软骨细胞增殖、延缓软骨细胞退变、抑制软骨细胞凋亡的方式改变软骨结构［24-25］。除此之外，荣筋拈痛方可抑制炎症因子分泌，对滑膜炎症也具有一定的缓解作用［26］。

与少量的蛋白质编码基因不同，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）占人类基因组的大部分，研究发现其可参与调控细胞增殖、分化、代谢等全过程，是转录及转录后修饰的关键因子［27］。ncRNAs包括miRNA、LncRNA 和环状RNA（circular RNA，circRNA）等［28］。miRNA 是一类长约20～22 个核苷酸的单链小RNA 分子。其在多种病理生理过程中起关键作用，一方面可直接结合靶基因mRNA 并使其降解，另一方面可抑制mRNA 的翻译以调控基因表达［29］。研究发现在膝关节腔内的滑液中存在miRNA，且其表达稳定，可根据滑液中不同miRNA的表达水平差异区分KOA 患者与正常人［30］。LncRNA 的长度＞200 nt，曾被认为不具有生物学功能，但目前发现其可通过参与修饰染色质、激活或干扰转录、核内运输等过程调控基因表达［31］。LncRNA 可通过多种途径参与缓解KOA，如LncRNA通过调控MMP 和ADAMTS 影响软骨机制的合成与分解代谢，LncRNA 参与调控软骨细胞的增殖与凋亡，LncRNA 通过NF-κB 与MAPK 途径参与调控炎症反应，LncRNA 参与调控滑膜关节血管生成，LncRNA 通过调控自噬影响软骨变性等［32］。通过基因调控网络的深入研究，发现许多疾病中LncRNA和miRNA 之间存在相互作用和相互调控。LncRNA H19 最早是由Tilghman 实验室发现的，其在小鼠胎儿肝脏中高表达，出生后下调，在控制细胞寿 命 过 程 中 扮 演 重 要 角 色［33］。LncRNA H19 是miRNA 前体转录物，miR-675 是其第1 个外显子区域加工产生的衍生物，LncRNA 可以通过成为具有调控功能的miRNA 的前体发挥作用［34］。

CollagenⅡ对软骨修复与再生起到了重要作用，研究者往往通过增加CollagenⅡ的表达或者抑制其降解的角度来延缓KOA 的进展［35］。当Aggrecan 合成受到抑制时，关节软骨会因失去滋养而出现软骨基质的损伤，最终发生骨关节退行性病变［36］。miR-675 对关节软骨合成代谢起促进作用，能有效延缓KOA 进展［37］。研究表明沉默LncRNA H19 或者miR-675 时，CollagenⅡ表达水平显著下调，过表达时则与之相反，但是否介导Aggrecan 的表达未曾报道［38-39］。可见，LncRNA H19/miR-675 表达水平的变化与软骨基质合成代谢密切相关［10，40］。

本研究结果显示，与空白组比较，模型组中LncRNA H19、miR-675 及其调控的CollagenⅡ、Aggrecan 基因表达水平降低；经过荣筋拈痛方与盐酸氨基葡萄糖治疗后，LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ、Aggrecan 基因表达水平升高，提示荣筋拈痛方可能通过上调LncRNA H19/miR-675 促进CollagenⅡ、Aggrecan 表达，从而延缓大鼠软骨退变，起到治疗KOA 的作用。