北极甜虾废弃物多肽钼螯合物的制备工艺研究

摘要：以北极甜虾虾壳多肽为原料，与三氧化钼螯合生成多肽钼螯合物。实验探索了北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼的质量比、螯合时间、螯合温度、螯合pH这4个因素对螯合率的影响，以确定最佳单一因素；再通过正交设计实验确定北极甜虾虾壳多肽钼螯合物的最佳制备工艺条件。实验结果表明：北极甜虾虾壳多肽钼螯合物的最佳制备工艺条件为：北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼的质量比为1∶5，螯合反应温度为55 ℃，螯合反应pH为6，螯合反应时间为120 min。

关键词：北极甜虾虾壳多肽；三氧化钼；单因素实验；正交实验

钼在人体内以有机螯合钼的形式存在，钼缺乏易引起肾结石和尿道结石，导致缺铁性贫血发生，可使体内的能量代谢过程发生障碍，致使心肌缺氧而出现灶性坏死［12］，因此，研究多肽钼螯合物有重要的价值。很多水产市场和公司由于加工虾类等水产品从而形成大量的废弃物，如果将虾壳等废弃物加工成多肽，并进一步合成多肽金属螯合物，可以形成高附加值产品，因其具有较高的抑菌性和抗氧化性，可以广泛应用于医药、食品等行业，同时能够做到废物利用，具有重要的经济意义和社会意义。

1材料与方法

1.1材料与试剂

北极甜虾虾壳，山东荣信水产食品集团股份有限公司提供；木瓜蛋白酶（800 μ/mg，生化试剂），山东卡贝因生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯），山东德彦化工有限公司；磷酸氢二钠（分析纯），廊坊市金海化工有限公司；盐酸（分析纯），济南竞宇新材料技术有限公司；考马斯亮蓝G250，沈阳晟达化工有限公司；磷酸（85%，分析纯），济宁市旭力化工有限公司；牛血清蛋白（生化试剂），西安泽邦生物科技有限公司；三氧化钼（分析纯），天津市光复精细化工研究所；氨水（分析纯），天津市津东天正精细化学试剂厂；氯化铵（分析纯），天津市化学试剂供销公司；氢氧化钠（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司；EDTA（分析纯），天津市福晨化学试剂厂；氧化锌（分析纯），天津市天成锦业国际贸易有限公司；铬黑T（分析纯），天津市欧博凯化工产品销售有限公司；氯化镁（分析纯），天津市鑫大宇化工有限公司；盐酸羟胺（分析纯），重庆市茂荣化工贸易有限公司。

1.2仪器与设备

FA1004B电子分析天平，上海佑科仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥机，沧州晶硕试验仪器有限公司；304中药粉碎机，邢台博泉机械科技有限公司；pH计，烟台凯米斯仪器有限公司；HH6恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DT56低速台式离心机，北京时代北利离心机有限公司；UV1601紫外分光光度计，北京北分瑞利分析仪器（集团）公司。

1.3实验方法

1.3.1北极甜虾虾壳多肽的制备

洗净北极甜虾壳，并在烤箱中干燥约4 h后取出，用研磨机压碎以制成虾壳粉［3］。取适量虾壳粉，用无水乙醇脱色，过滤后留取滤渣，滤渣用去离子水洗涤2～3次后，加入木瓜蛋白酶溶液进行酶解制取多肽，同时用磷酸氢二钠缓冲溶液和盐酸调节pH，提取制备一段时间后放进旋转蒸发仪进行离心分离，取上清液放进烘箱进行烘干，即得虾壳多肽。

1.3.2北极甜虾虾壳多肽钼螯合物的制备工艺研究

按照下面的工艺流程进行多肽钼螯合物的制备。

多肽→按比例加入三氧化钼→调整螯合条件→乙醇沉淀（乙醇含量达到90%以上，静置沉淀3 h）→抽滤→干燥→产品。

影响该制备工艺的主要因素有螯合温度、螯合pH、多肽与三氧化钼的质量比值、螯合时间等［45］，通过进行单因素实验和正交实验探索北极甜虾多肽钼螯合物制备的最佳工艺。运用络合滴定与反滴定法计算螯合率。

螯合率（%）＝（反应体系中钼的含量-游离钼含量）/反应体系中钼的含量 ×100%

2结果与讨论

2.1影响多肽钼螯合物制备的因素

2.1.1螯合温度对多肽钼螯合物螯合率的影响

在螯合pH为7、螯合时间为60 min、北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼的质量比为1∶3条件下，分别在温度为30、35、45、55、65、75 ℃下进行北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼的螯合反应。从图1中可以看出，温度从30 ℃增加到75 ℃时，螯合率先逐渐升高后缓慢降低，其中在螯合温度为45 ℃时，螯合率最高，可达到90.39％。

2.1.2螯合pH对产物螯合率的影响

在温度为45 ℃、时间60 min、虾壳多肽与三氧化钼的质量比为1∶3时，分别在pH为4、5、6、7、8时进行螯合反应。从图2中可以看出，其他条件恒定时，当pH为4至6时，螯合速率持续增加，而当pH为6～8时逐渐减少。pH超过6以后，氢氧根离子和给电子基团竞争钼离子优先结合形成氢氧化钼沉淀，不溶于水和碱。pH为6时螯合率最高，为84.08%，故pH选择6为宜。

2.1.3多肽与三氧化钼质量比对产物螯合率的影响

温度为45 ℃，时间60 min，pH为7，分别在多肽与三氧化钼的质量比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6时进行螯合反应。从图3中可以看出，其他条件恒定，随着北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼质量比值逐渐增加，螯合率明显增加，当质量比值为1∶4时，螯合反应的螯合率最高，为83.71%，当质量比值继续升高时，螯合率逐渐下降，当质量比值超过一定比值会造成药品浪费，并对环境造成污染。故选择北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼质量比值为1∶4左右为适宜。

2.1.4螯合反应时间对产物螯合率的影响

当温度在45 ℃，pH为7，多肽与三氧化钼质量比为1∶3时，分别在30、45、60、90、120、150 min内进行螯合反应，螯合率如图4所示。当其他条件恒定时，随着螯合时间的增加，螯合率逐渐增加，但是当时间超过90 min时，螯合率曲线急剧下降。螯合时间为90 min时，螯合率最高，为90.30％，因此最佳螯合时间应为90 min。

2.2正交实验

为了进一步优化螯合工艺，选择pH、北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼的质量比、螯合反应时间、螯合反应温度进行4因素3水平的正交实验，见表1。

由表1可知，从极差R值看，北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼制备螯合物的主要影响因素是Bgt;Cgt;Agt;D，即影响因素依次是螯合pH、北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼质量比、螯合温度、螯合时间。

根据以上实验还可以得到，多肽钼螯合的最佳制备工艺为：A3B2C3D3，即制备北极甜虾壳多肽钼螯合物的最佳工艺组合是螯合55 ℃，螯合pH为6，而北极甜虾壳三氧化钼的质量比为1∶5，螯合时间为120 min。

3结语

对北极甜虾废弃物进行多肽钼螯合物的制备，可以有效利用虾壳类废物，助力水产企业节能减排，为企业增加经济效益，并可提供更多的就业岗位。通过研究，可得出如下结论。

（1） 经过单因素实验可知：螯合温度、螯合pH、多肽与三氧化钼的质量比、螯合时间都会影响螯合率。北极甜虾多肽钼螯合的最佳单因素分别为：螯合温度45 ℃，螯合pH6，北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼质量比1∶4，螯合时间90 min。

（2） 正交实验最佳工艺为A3B2C3D3，即制备北极甜虾虾壳多肽钼螯合物的最佳工艺组合为：螯合温度55 ℃，螯合pH 6，北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼质量比1∶5，螯合时间120 min。

（3） 此次研究北极甜虾虾壳多肽钼螯合物的制备工艺也存在一些问题，如果北极甜虾虾壳多肽不够纯，在络合滴定法测螯合率过程中，滴定终点的判断不够准确，也会使螯合率计算不准确。参考文献：

［1］胡相红.微量元素钼与人类健康［J］.现代预防医学，2001，28（3）：353354.

［2］王丽，郭锋.生物微量元素钼与人体健康［J］.化学世界，2000，41（8）：446448.

［3］李云涛.虾壳活性肽的制备和生物活性研究［D］.舟山：浙江海洋学院，2013.

［4］杨集，邓尚贵，秦小明.低值鱼蛋白多肽一钙螯合物的制备和抗氧化、抗菌活性研究［J］.食品科学，2008，29（1）：202206.

［5］姜良萍，李博，罗永康等.鲢鱼源多肽锌的制备工艺对其抑菌活性的影响［J］.食品科技，2013，38（2）：125130.