正交试验法优选真武汤的微波提取工艺

任燕　何兴会

[摘 要] 目的：优选出真武汤的微波提取最佳工艺。方法：采用微波提取方法，通过单因素实验和正交实验两者结合考察了乙醇提取浓度、提取时间、微波火力、料液比对真武汤中芍药苷得率的影响，从而优选出最优提取工艺。结果：真武汤提取工艺最佳条件为：乙醇浓度为60%，微波时间为3min，微波火力中高火，料液比为1∶10。结论：本研究将为真武汤的剂型开发等进一步研究奠定基础。

[关键词] 真武汤；芍药苷；微波提取；正交实验

[中图分类号]R284.2 [文献标志码] A [文章编号]1007-8517（2015）06-0008-02

真武汤出自《伤寒论》，系张仲景针对少阴肾阳亏虚，气不化水，水气内停而设。全方由炮附子、白术、茯苓、生姜、芍药等五味药组成，具有扶阳抑阴、化气行水的效果，适用于脾肾阳虚、水气内停等证，为温阳利水之经典方。后世医家对本方进行了较为系统的研究，目前已突破了水病的范围，用本方治疗多个系统的疾病，如：慢性支气管炎、肺气肿、肺心病、风心病、冠心病、充血性心力衰竭、慢性胃肠炎、肝硬化腹水、慢性肾炎、内耳性眩晕、血栓闭塞性脉管炎等疾病，疗效令人满意。该方虽应用很广，但对该方的提取工艺还未见有研究，从而也制约该方的制剂开发，故本文通过单因素及正交试验对真武汤的提取工艺作初步研究，以期能为开发该方新制剂奠定一定基础。

1 仪器和试剂

1.1 仪器 WP700L17微波炉；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；UV-VIS分光光度计（UV-2450，日本岛津公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（上海浦东光学仪器厂）。

1.2 材料 芍药苷标准品（中国药品生物制品鉴定所）；所用试剂均为分析纯；中药材炮附子、白术、茯苓、芍药购于贵阳市药材公司，生姜购于菜市场；炮附子、白术、茯苓、芍药用粉碎机粉碎得药材粗颗粒；生姜切块，备用。

2 方法

2.1 芍药苷含量得率的测定方法

2.1.1 标准品的制备 精密称取100℃干燥恒重的芍药苷标准品4.8mg于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.1920mg/ml标准储备液。精密量取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5ml分别置于10ml容量瓶中，编号为1、2、3、4、5、6，加入甲醇定容至10ml，摇匀，甲醇做空白对照。

2.1.2 芍药苷标准曲线的制作 将配制好的对照品溶液进行波长确定，选出最大波长，最后确定最大波长为230nm。在230nm波长处测定吸光度，以浓度对吸收值做线性回归，得出回归方程：Y=30.007X-0.0273，R2=0.9994，其中X是芍药苷标准品的浓度，Y是吸光度值。

2.1.3 供试品的制备 准确称取按真武汤复方处方准备好的药材量的1/3（既茯苓3.00g，芍药3.00g，生姜3.00g，白术2.00g，炮附子1.40g）至250ml锥形瓶中，精密加入一定浓度的乙醇溶液后置微波炉中提取，冷却后补足失去的乙醇量，滤过，精确量取一定滤液（V），蒸发至近干，加甲醇溶解，转入25ml容量瓶中，并定容至刻度，即得供试品溶液。

2.1.4 芍药苷得率测定 取供试品溶液于230nm波长处测定吸光度值，然后带入所得线性回归方程中计算，即可得样品中芍药苷的浓度，经进一步计算就得其得率。芍药苷得率的计算公式：得率=X×100×（25/V）×10-3/W*100%，式子中X为样品液中芍药苷的浓度（mg/ml），V为精确量取蒸发的液体（ml），W为真武汤药材总质量。

2.2 单因数实验

2.2.1 提取时间的影响 分别取按处方准备好的药材量的1/6（既茯苓1.50g，芍药1.50g，生姜1.50g，白术1.00g，炮附子0.70g），各六份，混匀。按料液比为1∶15加入70%的乙醇溶液，设定微波火力为中火（P=50），微波提取时间分别为1、2、3、4、5、6min，得提取液，最后测定芍药苷的吸光度。

2.2.2 微波火力的影响 分别取按处方准备好的药材量的1/6（既茯苓1.50g，芍药1.50g，生姜1.50g，白术1.00g，炮附子0.70g），各五份，混匀。按料液比为1∶15加入70%的乙醇溶液，设定微波时间为3min，微波火力分别为微火（P=10）、中微火（P=30）、中火（P=50）、中高火（P=80）、最大火（P=100），得提取液，最后测定芍药苷的吸光度。

2.2.3 料液比的影响 分别取按处方准备好的药材量的1/6（既茯苓1.50g，芍药1.50g，生姜1.50g，白术1.00g，炮附子0.70g），各五份，混匀。分别按料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25加入70%的乙醇溶液，设定微波火力为中火（P=50），微波提取时间为3min，得提取液，最后测定芍药苷的吸光度。

2.2.4 乙醇浓度的影响 分别取按处方准备好的药材量的1/6（既茯苓1.50g，芍药1.50g，生姜1.50g，白术1.00g，炮附子0.70g），各五份，混匀。按料液比为1∶15分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，设定微波火力为中火（P=50），微波提取时间为3min，得提取液，最后测定芍药苷的吸光度。

2.2.5 单因素实验结果 随着提取时间的增加芍药苷的吸光度值先增大后减小，且在4min时有最大值；随着微波火力的增大，芍药苷的吸光度值先增大后减小，且在微波火力为中高火时有最大值；随着料液比的增大，芍药苷的吸光度值逐渐增大，后趋于平衡，其中在1∶20、1∶25时，趋于平衡；随着乙醇浓度的增大，芍药苷的吸光度值先增大后减小，且在浓度为70%时有最大值。

2.3 正交试验

2.3.1 正交实验 分别称取按处方准备好的药材量的1/3（既茯苓3.00g，芍药3.00g，生姜3.00g，白术2.00g，炮附子1.40g），各9份，混匀，根据单因素实验结果，进行L9（34）正交试验（见表1）。

2.3.2 正交实验的结果 由表2可知，根据K值各因素对实验指标的影响按大小次序排列为A>D>B>C，即乙醇浓度>料液比>微波时间>火力。由方差分析F值大小可得从真武汤中提取芍药苷的最佳条件为：A2B2C3D1，即乙醇浓度为60%，微波时间为3min，微波火力中高火，料液比为1∶10。

2.3.3 实验验证 取上述处方药材三份，分别按上述最佳工艺条件A2B2C3D1，即乙醇浓度为60%，微波时间为3min，微波火力中高火，料液比为1∶10，对实验结果进行验证，见表3。

由表3可知，按照正交试验所优选而得的最佳工艺进行提取试验，三次结果芍药苷含量均处于较高水平，这说明该最佳工艺是稳定可行的。

3 讨论

真武汤为经典方剂，临床用于心血管系统疾病、呼吸系统疾病、肾脏疾病、妇科疾病以及神经系统疾病等。现代研究证实，该方不但具有利尿、强心的作用，还有保护受损心肌、消除自由基、提高机体应激、促进新陈代谢抗衰老等作用[1]。李景巍[2]、刘崇新[3]、荆世常[4]、何幼斌[5]等应用真武汤在临床上取得很好疗效。该方虽应用很广，但未见该方提取工艺的研究，从而也制约该方的制剂开发。另外，微波提取技术具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低、质量好等许多优点，是天然产物提取中一种非常有发展潜力的新型技术[6-8]。因此本文选择以乙醇浓度、微波时间、微波火力、料液比四个因素对真武汤中芍药苷的提取工艺进行考察，采用单因素以及正交实验两者相结合，以芍药苷为检测指标，考察真武汤中芍药的提取工艺。吴谦认为[9]：“真武汤尤妙在芍药之酸收，仲景之旨微矣。盖人之身阳根于阴，若徒以辛热补阳，不少佐以酸收之品，恐真阳飞越矣，用芍药者，是亟收阳气归根于阴也，于此推之，则可知误服青龙致发汗亡阳者，所以于补阳药中之必需芍药也。”所以检测芍药苷的含量具有代表性，芍药苷含量多少与该方的有效部位的溶出度有密切关系。故本实验用紫外分光光度法测定芍药苷得率，方法简单、易操作，且乙醇提取溶出的杂质少、溶剂可回收、比较经济。实验结果表明最佳的提取工艺为：乙醇浓度为60%，微波时间3min，微波火力中高火，料液比1∶10；且验证实验结果表明该最佳工艺是稳定可行的。本文通过单因素及正交试验对真武汤的提取工艺作初步研究，以期能为开发该方新制剂奠定一定基础。

参考文献

[1]孟涌生.真武汤的现代研究[J].北京中医，2007，26（9）：628-631.

[2]李景巍.真武汤加减治疗老年原发性高血压病40例[J].河南中医，2009，29（7）：640-641.

[3]刘崇新.真武汤化裁治疗上呼吸道感染后久咳138例[J].安徽中医临床杂志，2000，12（2）：82.

[4]荆世常.真武汤加减治疗老年性遗尿95例[J].河南中医，2011，31（1）：14.

[5]何幼斌.真武汤治疗尿路结石并肾积水30例[J].湖北中医杂志，2003，25（4）：35.

[6]张萍，廖正根，梁新丽，等.均匀设计优选舒胸片处方药材的微波辅助提取工艺的研究 [J].中草药，2009，40（1）：45-49.

[7]欧阳丽娜，李兰林，吴雪，等.正交设计优选竹节参总皂苷微波提取工艺的研究[J].中草药，2010，41（10）：1639-1642.

[8]龚盛昭，程江，杨卓如.微波场协同提取芦丁[J].精细化工，2003，20（12）：758-760.

[9]丁晓兰，袁媛，赵志梅.韩冰教授谈真武汤之君药[J].吉林中医药，2013，33（11）：1151-1152.