N乙酰L缬氨酸的合成与分析

摘要：建立高效液相色谱紫外检测分离测定L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸的方法，以此为手段对N乙酰L缬氨酸的制备过程进行监控。研究了以L缬氨酸为原料，乙酸酐为乙酰化试剂制备N乙酰L缬氨酸的工艺。确定了乙酰化反应条件、中和结晶条件等，获得的优化工艺条件为：100 gL缬氨酸，500 mL水，90 mL乙酸酐，温度35 ℃，pH 8.0，反应时间2 h。随后用37%浓盐酸中和至pH 1.5，旋转蒸发，冷却结晶12 h，得N乙酰L缬氨酸产品。母液浓缩回收利用。产品总收率为122%，通过FTIR，HNMR和HPLC对其结构进行了确证，质量达到行业标准。

关键词：N乙酰L缬氨酸；乙酰化；L缬氨酸L缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，属于支链氨基酸，也是人体必需的8种氨基酸和生糖氨基酸，与异亮氨酸和亮氨酸一起作用可以促进身体正常生长，修复组织，调节血糖，并提供机体所需要的能量［1］。N乙酰L缬氨酸为重要的精细有机化工中间体，广泛应用于医药、农药、化学工业等领域［2］。氨基酸均有一个aNH2，可以与适当的乙酰化试剂反应，常用的乙酰化试剂有乙酸、乙酰氯和乙酸酐。使用乙酸进行乙酰化需在高温下反应，易导致氨基酸消旋；乙酰氯的反应活性过强，容易水解，不宜在水溶液中进行反应。因此最常用的乙酰化试剂是乙酸酐，在微碱性的水溶液中与氨基酸反应生成乙酰氨基酸［35］。

已有N乙酰L酪氨酸、N乙酰L半胱氨酸、N乙酰L亮氨酸、N乙酰L谷氨酸、N乙酰L苏氨酸等乙酰氨基酸制备的报道［611］。基本工艺是：将氨基酸溶解在弱碱性水溶液中，加入乙酸酐进行乙酰化反应，再从反应液中分离提取目标产物。由于各种氨基酸的侧链基团不同，物理、化学性质有很大差异，因此制备各种乙酰氨基酸的工艺方法和工艺参数都有所不同。尚未报道N乙酰L缬氨酸的制备。

高效液相色谱结合紫外检测已被用于酪氨酸等氨基酸的分离测定［1214］，也被用于某些乙酰氨基酸的分离测定，如乙酰半胱氨酸，乙酰酪氨酸等［1520］。但未见分离测定L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸的报道。

本文首先建立了一种高效液相色谱紫外检测分离测定L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸的方法。以此为手段对制备N乙酰L缬氨酸的工艺过程进行监控，研究了乙酸酐用量、反应温度、反应时间等对乙酰化反应的影响，研究了产品的优化结晶条件，由此确定优化的制备工艺参数。

1实验部分

1.1仪器与试剂

LabTECH高效液相色谱仪：北京莱伯泰科仪器有限公司，配备紫外检测器；旋转蒸发器（RE-301E）：上海互佳仪器设备有限公司）；酸度计（PHS-25）：杭州雷磁分析仪器厂；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-10S）：天津华鑫仪器有限公司；蠕动泵（BT-100）：重庆杰恒蠕动泵有限公司；循环水式多用真空泵（SHZ-D140）、傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet iS50）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；500 MHz核磁共振谱仪：AVANCE，美国布鲁克科技有限公司。

L缬氨酸：工业级，江苏汉菱生物工程有限公司提供；L缬氨酸标准品：采用工业级L缬氨酸精制；N乙酰L缬氨酸标准品：自制N乙酰L缬氨酸再精制；乙酸酐： 分析纯；氢氧化钠：工业级片碱，重庆天原化工公司；浓盐酸：37%，分析纯；甲醇为色谱纯试剂。其他试剂为分析纯以上。

1.2实验方法

1.2.1高效液相色谱分离测定L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸1.2.1.1标准对照液的制备

分别称取0.250 g L缬氨酸、N乙酰L缬氨酸标准品，混合后加水溶解，转入250 mL容量瓶中以水定容，得质量浓度为1.00 g/L的L缬氨酸、N乙酰L缬氨酸混合标准溶液。试验时根据需要，准确移取适量混合标准溶液，稀释至一定体积，制备一定质量浓度的标准对照液。

1.2.1.2供试液的制备方法

准确移取或称取适量的样品，用水溶解后转入100 mL容量瓶中定容。

1.2.1.3色谱条件

色谱柱（C18，5 μm，250×4.6 mm id），流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，进样体积20 μL，检测波长210 nm。

流动相：40/60甲醇/10 mmol/L磷酸盐，pH 3.0。其中10 mmol/L磷酸盐溶液：称取1.36 g磷酸二氢钾，加水约900 mL溶解，用10%稀磷酸调pH至3.0，再加水至1 000 mL。

1.2.2N乙酰L缬氨酸的制备方法

1.2.2.1L缬氨酸的乙酰化

将250 mL三口瓶置于磁力搅拌恒温水浴锅中，加入10 g L缬氨酸、100 mL水，将酸度计的pH电极插入瓶中监控物料pH。调节水浴锅温度至规定值，滴加30%NaOH至规定的pH。此时为乙酸酐加入零点，开始滴加规定量乙酸酐，同时滴加30%NaOH维持在规定的pH，滴加乙酸酐总耗时2 h，滴加完乙酸酐后再反应0.5 h。

1.2.2.2中和结晶

加37%浓盐酸中和至pH 1.5。旋转蒸发至70 mL，降温，搅拌结晶，12 h后抽滤，用水洗3次，80 ℃烘干得N乙酰L缬氨酸精品。母液另行处理。

1.2.2.3回收母液中N乙酰L缬氨酸

母液与洗水合并，旋转蒸发至出现结晶，缓缓降温，搅拌结晶，12 h后抽滤，得N乙酰L缬氨酸粗品，可用于下一批乙酰化时配料。

2结果与讨论

2.1分析方法的建立

通过实验研究，建立了高效液相色谱分离测定L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸的方法。典型色谱图见图1。

2.2乙酰化反应的影响因素

乙酸酐是氨基进行乙酰化的常用试剂，其反应活性适中，反应条件易控制。可在水溶液中与氨基酸的氨基反应生成N乙酰氨基酸。本研究选择乙酸酐对L缬氨酸进行乙酰化，反应式见图2。

在水溶液中，乙酸酐还会发生水解副反应，导致参与主反应的乙酸酐减少，需要增加乙酸酐用量。在乙酰化反应和乙酸酐水解过程中都会生成大量乙酸，为维持反应体系的pH，需加碱中和反应中产生的乙酸。

2.2.1乙酸酐用量对乙酰化反应的影响

采用1.2.2.1的方法，控制乙酰化反应pH在8.0左右，水浴温度为35 ℃，在滴加乙酸酐反应阶段，每滴加一定量乙酸酐，暂停滴加乙酸酐，但继续滴加30%NaOH维持pH，至pH不再降低为止。按1.2.1的方法对反应液取样，进行液相色谱分析，测定其中L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸的含量，根据测定结果及取样时物料总质量，计算L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸在反应液中的质量。结果见图3。

实验中发现，反应初期，溶液中的L缬氨酸与滴入的乙酸酐反应，导致其质量逐渐降低；生成N乙酰L缬氨酸的质量逐渐升高。直至乙酸酐用量达到9 mL以后N乙酰L缬氨酸曲线逐渐走平，残留在反应液中的L缬氨酸趋近于0 g。

表明L缬氨酸已被全部乙酰化，不再有新的N乙酰L缬氨酸生成。

理论上10 g L缬氨酸（0.085 4 mol）乙酰化需消耗乙酸酐8.1 mL。实验表明，当乙酸酐加入量为9 mL，即理论加入量的111%时， 溶液中已无L缬氨酸存在。为保证L缬氨酸反应完全，本研究选择乙酸酐加入量为9 mL。

2.2.2反应pH对乙酰化反应的影响

乙酸酐对氨基酸乙酰化一般宜在微碱性水溶液中进行，为考察反应pH对乙酰化反应的影响，按1.2.2.1的方法，控制乙酰化反应pH为不同值，水浴温度为35 ℃，均滴加9 mL乙酸酐，反应终止后取样分析，计算反应液中L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸的质量，结果见图4。

实验发现，在pH 8～9的条件下乙酰化，都可以将L缬氨酸全部转化为N乙酰L缬氨酸；在pH 7的条件下乙酰化，会有少量L缬氨酸残留；在pH 10的条件下乙酰化，也有少量L缬氨酸残留。后面两种情况下如果继续滴加乙酸酐，仍然可以将所有L缬氨酸全部乙酰化，总的效果就是增大了乙酸酐的消耗量。本研究选择在pH 8.0的条件下进行乙酰化反应。

2.2.3反应温度对乙酰化反应的影响

为考察反应温度对乙酰化反应的影响，按1.2.2.1的方法，控制乙酰化反应pH为8.0，控制水浴温度为规定值，均滴加9 mL乙酸酐，反应终止后取样分析，计算反应液中L缬氨酸和N乙酰L缬氨酸的质量。

实验发现， 在25～55 ℃范围内，反应温度对乙酰化反应没有明显的影响，在55 ℃下乙酰化，反应液中残留少量L缬氨酸，仅占总量的1%左右。25～45 ℃条件下乙酰化，所有L缬氨酸全部乙酰化。本研究选择在35 ℃下进行乙酰化反应。

2.2.4反应时间对乙酰化反应的影响

由于可能存在乙酸酐水解的副反应，因此在乙酰化反应过程中，采用滴加乙酸酐的方式，而不是一次性加入全部乙酸酐。滴加乙酸酐的速度可能影响乙酰化反应。实验发现，乙酰化反应速度较快，滴加速度对乙酰化反应没有太大的影响，1 h滴完与3 h滴完乙酸酐，测定反应液中各组分质量，发现乙酰化反映的情况没有明显区别。考虑到滴入的乙酸酐在溶液中的搅拌分散情况，以及乙酸酐水解影响，滴入乙酸酐不应太快。本研究选择在2 h内滴完乙酸酐。

2.3N乙酰L缬氨酸的中和结晶

水解后的反应液中含有目标产物N乙酰L缬氨酸，还含有高质量浓度的乙酸钠及少量其他副产物。需将目标产物从反应液中结晶分离出来。

N乙酰L缬氨酸有一个游离羧基，其酸碱性质类似于乙酸，在较高pH下部分离解生成带负电荷的离子。只有在较低的pH条件下才会以不带净电荷的中性分子形式存在，此时其溶解度最低。因此实验中加入盐酸中和至pH 1.5。

由于N乙酰L缬氨酸在溶液中的溶解度较大，需将中和液旋转蒸发至70 mL，取下冷却结晶，20 ℃条件下过滤分离，洗涤，干燥得到N乙酰L缬氨酸精品10.6 g。得母液52 mL， 其中N乙酰L缬氨酸质量浓度为19 g/L，质量为0.98 g。洗水30 mL，其中N乙酰L缬氨酸质量浓度为50.5 g/L，质量为1.52 g。

经检测，N乙酰L缬氨酸产品质量符合行业标准（见表1）。

2.4母液处理

产品结晶母液及洗水中还含有一定量的N乙酰L缬氨酸，如果能部分回收，则产品收率可进一步提高。此母液中还含有高浓度的乙酸钠和氯化钠。实验发现，N乙酰L缬氨酸在纯水中的溶解度较大，在含有乙酸钠和氯化钠的溶液中溶解度较小。在饱和盐溶液中溶解度最小。因此，将结晶母液及洗水合并，再旋蒸至盐结晶刚刚出现，冷却，使N乙酰L缬氨酸结晶析出，过滤，不洗，可得N乙酰L缬氨酸粗品2.3 g（干重），经HPLC测定其中含N乙酰L缬氨酸70%，总量为1.6 g。此粗品在下一批次乙酰化时加入反应液中。

2.5原料消耗定额及产品收率

按照本研究选定的工艺条件进行放大实验，每次固定投料量为100 g L缬氨酸，并投入上一批次母液中回收的N乙酰L缬氨酸粗品，连续运行4批。得到制备N乙酰L缬氨酸工艺的原料消耗定额和产品收率，结果见表2。

3产物结构表征

3.1FTIR

主要官能团的吸收频率为：υ（O—H），3 303 cm-1，υ（N—H），3 101 cm-1，2 968 cm-1，υas（COO），1 604 cm-1，υs（COO），1 396 cm-1，υ（C—O），1 205 cm-1，由此可以确定该谱图为N乙酰L缬氨酸的红外吸收光谱图（见图5）。

3.2HNMR

图6为产物HNMR。由图6可见：d=12.50处为—COOH中氢原子的共振峰，是受氨基吸电子效应影响的氢。d=8.00处为QSChNa中氢原子的共振峰；d=4.13处为—NH中氢原子的共振峰；d=1.87～2.06处为—CH2中氢原子的共振峰；d=0.87处为产物以甲基封端的—CH3的氢原子共振峰。

综合FT-IR和HNMR表征结果，证明产品为N乙酰L缬氨酸。

4结论

在微碱性水溶液中，用乙酸酐乙酰化L缬氨酸可制备N乙酰L缬氨酸。工艺条件温和，操作简便。优化工艺条件为：

（1） 乙酰化：100 g L缬氨酸，1 000 mL水，35 ℃，滴加90 mL乙酸酐，滴加30%NaOH保持pH 8.0。滴加乙酸酐时间2 h。

（2） 中和结晶：加37%浓盐酸中和至pH 1.5。旋转蒸发至溶液体积700 mL，冷却结晶12 h，抽滤，洗涤，80 ℃烘干得N乙酰L缬氨酸精品。

（3） 母液处理：旋转蒸发至出现结晶，冷却结晶12 h，抽滤，得N乙酰L缬氨酸粗品，可用于下一批乙酰化时配料。产品总收率为122%，产品质量符合行业标准。

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