2型糖尿病病人血清MMP9和PI3K水平与心房颤动的相关性研究

王伟杰 ，高 琦，孙正宇，王 聪，丁洋洋，黄浩东，康品方,2，唐 碧

心房颤动(atrial fibrillation，AF)是临床上最常见的心律失常类型之一，随着人口老龄化的发展，其发病率呈逐年上升的趋势。AF是导致心血管疾病的主要危险因素，其通过损害心脏功能显著增加病人心力衰竭、卒中和血栓栓塞的发病率和死亡率。AF可分为阵发性AF(paroxysmal atrial fibrillation，PaAF)、持续性AF(persistent atrial fibrillation，PeAF)和永久性AF(permanent atrial fibrillation，PerAF)。AF发生的确切原因和机制尚不十分清楚，是目前研究的热点。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是导致AF发生的主要危险因素之一，2型DM(T2DM)是DM中最常见的类型，占DM病人90%以上，先前有研究表明，T2DM病人通过氧化应激或炎症反应介导心房的结构重构和电重构，继而导致AF的发生[1]。血清基质金属蛋白酶9(MMP9)活性或表达增高会导致氧化应激或炎症反应[2]。MMP增生、沉积是心肌纤维化的重要进程[3]。动物试验表明，DM大鼠通过促进心房纤维化、延长房间传导时间，从而增加AF易感性[4]。因此，MMP9在T2DM病人AF的发生发展中可能有着重要作用。另外，有证据表明，抗氧化剂可通过激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)活性及其相关的信号通路，减轻DM大鼠的心房重构，降低其AF的易感性[1]。可见PI3K在T2DM和AF之间的关系中可能起着非常重要的作用。

MMP9水平升高、PI3K水平降低均可介导不同程度的氧化应激和炎症反应[2]。目前对MMP9、PI3K的研究在T2DM病人AF疾病中的作用尚未有明确报道。左心房内径(LAD)作为描述以心脏大小及几何形态改变为特征的心房结构重构指标，已证实其与AF的发生发展有关，因此可以将LAD增大作为AF发生的独立危险因素。本研究通过测定血清中MMP9和PI3K的水平，探讨血清MMP9和PI3K与已知预测因子LAD之间的关系，探索MMP9及PI3K在AF发生发展过程中的作用，为AF的诊断和预后评估提供一定的参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020-2021年蚌埠医学院第一附属医院住院T2DM病人290例，其中200例为T2DM的AF病人，将AF病人分为3组，PaAF组62例，PeAF组70例，PerAF组68例。另外90例为心电图正常的T2DM病人，称为单纯性DM组，作为对照组。病人入选标准：经心电图、24 h动态心电图、心电事件记录仪等明确记录到AF发作；AF的分类依据2010 年欧洲心脏病学会(ESC)AF治疗指南[5]。排除T2DM病人中合并各种感染性疾病、风湿性心脏病、高血压、心肌病、冠心病、甲状腺功能亢进及严重肝肾疾病。各组在性别、年龄、基础疾病等因素上相互匹配。所有受试者签署知情同意书，并获得蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会批准(2019KY023)。

1.2 样本准备 标本准备：通宵禁食后的早上采集所有病人的外周血置于EDTA抗凝管中，2 h内以2 000 r/min离心 10 min，取离心后的上层血浆，血浆置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 ELISA法检测各组病人血清中MMP9及PI3K水平 使用 Human MMP9、PI3K检测试剂盒，按ELISA厂家检测说明，测定人血清MMP9、PI3K表达水平。操作步骤均严格遵循试剂自带说明书执行。检测中严格质控。

1.4 Western blotting检测MMP9、PI3K蛋白在对照组和AF病人中的表达情况 使用已分装好的血浆，加入 RIPA 后冰上裂解30 min，4 ℃离心机中15 000 r/min离心30 min，提取血浆总蛋白，根据BCA蛋白定量法说明书测各组蛋白浓度，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，95 ℃变性5 min，每组取40 μg蛋白，配置10% SDS-PAGE凝胶，根据计算所得体积上样后电泳(60 V，30 min待Marker出现条带分离后，调整为120 V，90 min待15 000相对分子质量到达胶下缘是停止电泳)；转膜(200 mA，2 h)至PVDF膜上； 5% BSA封闭液室温封闭2 h；一抗4 ℃孵育过夜，内参选用β-actin ；TBST洗涤3次，每次15 min；二抗室温孵育2 h；TBST洗涤3次，每次15 min； ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统获取图像。

1.5 超声心动图检查 所有受试者接受超声心动图检查。排除结构性心脏病，确定心房、心室有无血栓。测量LAD和左心室射血分数(LVEF)。

1.6 统计学方法 采用单因素方差分析、q检验、Pearson相关性分析和二元logistic回归分析。ImageJ8.0软件分析Western blotting条带灰度值，Graphpad-prism8.3.0进行统计学分析。

2 结果

2.1 病人临床基线资料比较 各组研究对象的基本资料、肝肾功能、血常规、血脂等指标间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。各组研究对象LVEF、LAD的差异均有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

表1 4组受试者基线资料的比较

分组nPLT/(×109/L)Scr/(μmol/L)ALT/(U/L)AST/(U/L)LAD/mmLVEF/%对照组90210.29±42.0167.10±10.7921.64±11.0124.39±5.7937.43±3.1160.19±6.54PaAF组62211.39±53.3468.42±15.0224.38±12.2326.12±9.8740.10±3.0958.67±4.66PeAF组70210.12±40.6570.79±16.3224.19±12.2926.39±8.0742.81±2.0955.27±4.16PerAF组68207.00±40.1067.69±18.1924.01±12.1025.95±12.1144.57±3.2854.92±3.14F—0.120.860.970.8288.6720.96P—>0.05>0.05>0.05>0.05<0.01<0.01MS组内—1931.395226.117140.36381.2778.62024.426

续表1

2.2 受试者血清MMP9及PI3K水平的比较 与对照组相比，PaAF、PeAF与PerAF组 MMP9 表达水平明显升高(P<0.01)、PI3K表达水平明显降低(P<0.01)。与PaAF组相比，PeAF组与PerAF组 MMP9 表达水平升高(P<0.01)、PI3K表达水平降低(P<0.01)。与PeAF组相比，PerAF组 MMP9 表达水平升高(P<0.01)、PI3K表达水平降低(P<0.01)(见表2)。

表2 各组MMP9、PI3K水平比较

2.3 受试者血清MMP9、PI3K Western blotting检测结果 Western blotting检测结果显示，与对照组相比，PaAF、PeAF与PerAF组 MMP9 表达水平升高(P<0.01)、PI3K表达水平降低(P<0.01)。与PaAF组相比，PeAF组与PerAF组 MMP9 表达水平升高(P<0.01)、PI3K表达水平降低(P<0.01)。与PeAF组相比，PerAF组 MMP9 表达水平升高(P<0.01)、PI3K表达水平降低(P<0.01)(见图 1、表3)。

表3 各组MMP9、PI3K蛋白表达水平比较

2.4 实验组血清MMP9、PI3k水平和LAD的相关性分析 经Pearson线性相关分析,实验组中MMP9水平与LAD呈正相关关系(r=0.842，P<0.05)；实验组中PI3k水平与LAD呈负相关关系(r=-0.868，P<0.05)。MMP9与 PI3k水平呈负相关关系(r=0.913，P<0.01)。

2.5 二元logistic回归分析 纳入MMP9 、 PI3K和LAD行logistic回归分析(均以实测值赋值)，结果显示MMP9 、 PI3K 、LAD 是 AF 的危险因素(见表4)。

表4 logistic 多因素回归分析结果

3 讨论

AF是最常见的持续性心律失常类型之一，其临床危害大。DM是AF的独立危险因素[2]，合并DM的AF病人其卒中、心衰发生率以及血管栓塞风险等均增加[3-4]。且T2DM占DM病人90%以上，因此，探讨阐明T2DM合并AF发生机制显得尤为重要。有研究[5-6]报道，T2DM病人长期的高血糖水平、胰岛素抵抗导致氧化应激或炎症反应水平增高。而炎症因子MMP9、PI3K水平的显著异常均可引起氧化应激和炎症反应[2]。因此，本研究在既往的研究基础上，通过分析T2DM合并AF病人血清中MMP9、PI3K的表达水平及其与AF发生的关系，以期能够对AF的早期诊断作出评估，为AF的临床治疗提供新思路。

MMPs是一个内源性锌依赖性酶家族，是降解 ECM的蛋白水解酶系统，MMPs激活可导致细胞外基质(ECM)中的几乎所有的成分降解，介导正常组织和病理组织的重塑[7-9]。在MMPs家族中，MMP9与AF的关系最为密切，既往有学者报道，AF病人心房组织中MMP9表达水平较非AF病人组显著增高[10]。研究[11]发现，DM大鼠MMPs表达和活性增加，进而引起心房的结构重构和电重构，继而导致AF的发生。本研究结果显示，T2DM合并AF病人血清中MMP9表达水平较Con组显著增高，另外，MMP9水平在PerAF组高于PeAF组高于PaAF组。本研究Western blotting中各蛋白表达量与上述趋势符合，结果进一步得到了证实。这也进一步证明MMP9表达水平的增加与AF的发生发展有着密切的联系，其可能机制为，MMP9水平升高，MMP与组织抑制剂之间的平衡被破坏[12-13]，触发并促进心房ECM重塑和心房结构重构，进而导致AF的发生发展。

PI3K为一种心脏保护蛋白，具有心脏保护活性。实验证实，降低糖尿病心肌病小鼠心脏中的PI3K活性可加速DCM小鼠心力衰竭的进展并导致其AF的发生发展[14-16]。既往有研究通过敲除小鼠的PI3K基因发现，其PI3K 活性降低，心房纤维化增加，心房钾通道表达下调，AF易感性增加[17-19]。我们研究发现，T2DM合并AF病人血清中PI3K表达水平较对照组显著增高；另外，血清PI3K水平在PerAF组低于PeAF组低于 PaAF组。本研究Western blotting中各蛋白表达量与上述趋势符合，进而提示了PI3K表达水平的降低与AF的发生发展密切相关。

MMP9、PI3K表达水平的异常均可介导不同程度的氧化应激或炎症反应，进而导致AF的发生[2]，本研究进一步探讨其与T2DM病人AF不同类型是否存在相关性。有研究表明,AF伴随着持续的炎症反应、心肌组织损伤及修复过程，最终导致心腔发生慢性失代偿性扩大,LVEF明显低于正常组， LAD明显高于正常组[20-23]。本研究通过 Pearson相关性分析,发现血清MMP9与LAD之间呈现一定正相关，PI3K与LAD之间呈现一定负相关，提示血清MMP9水平的升高、PI3K水平的降低可反映后期心腔扩大。这些结果表明，MMP9和PI3K或通过调控心肌细胞的增殖、纤维化促进心房重构等，参与AF的发生发展。另外，我们对血清MMP9和PI3K行logistic回归分析，结果显示二者均为T2DM病人AF的危险因素。故结合本文MMP9 在 AF 中的表达水平升高、PI3K在 AF 中的表达水平降低可显示，其可能通过相关炎性通路使左心房发生慢性炎症，增加了 AF 再发恶性事件的风险。

综上所述，本研究发现T2DM合并AF病人血清MMP9水平明显升高，与AF的持续时间呈正相关；PI3K水平明显降低，与AF的持续时间呈负相关。T2DM病人可能通过血清MMP9水平显著升高、PI3K水平显著降低介导氧化应激水平增高和慢性炎症，进而导致AF的发生发展，这有利于T2DM病人AF的早期诊断及严重程度的评估，为临床防治提供了新的方向和广阔前景。