添加菊粉和单宁对湖羊瘤胃挥发性脂肪酸和微生物区系的影响

■王小凤 何兆华 梁 雪 席启明 孙红先 李少斌 赵芳芳

（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃兰州 730070）

饲料添加剂不仅可以改善瘤胃内环境，而且还可以增强或抑制特定的微生物菌群结构[1]。长期以来，反刍动物营养学家一直寻求通过改善饲料配方和添加剂来提高能量和蛋白质的利用率，以改善不同瘤胃微生物群之间的竞争。菊粉作为一种功能性植物多糖，其化学本质是果聚糖，主要存在于菊芋等多种植物的根、茎和一些藻类当中[2]。菊粉主要由β（1，2）糖苷键连接果糖单体，进而形成低聚果糖，其聚合度（DP）通常为2～60，平均DP 为10[3]。DP≤10 的菊粉称为短链菊粉，又名果寡糖，DP＞10 则称为长链菊粉[4]。近年来因其具有改善抗氧化性能、改善微生物环境和菌群数量以及增加机体免疫力等特点[5]，被用作绿色、安全、无毒无害的饲料添加剂之一。田可[6]研究发现，在低精料日粮中添加菊粉可以显著增加瘤胃中乙丙比的比例，改变瘤胃发酵模式，调节瘤胃微生物菌群的组成与比例；在高精料日粮中添加菊粉可以使瘤胃菌群的丰度与多样性增加，优化菌群的组成与比例。此外，菊粉在人、小鼠、猪上的应用都已取得较好的效果[7-9]。

单宁是一种广泛存在于自然界中的多酚类化合物，能与蛋白质结合，从而降低蛋白质在瘤胃中的降解速度。另外，单宁也可以与多糖、消化酶和金属离子等发生络合，形成螯合物[10]。有研究发现单宁可通过螯合金属、抗氧化等作用机制来预防和治疗肠胃炎症和腹泻[11]。但作为一种抗营养因子，添加量过多会对动物产生毒副作用。而聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）是目前研究较为广泛的竞争试剂，它与单宁的结合能力要比蛋白质强[12]。有研究发现PEG 能减弱单宁对酶和微生物活性的抑制作用，提高营养物质在瘤胃中的消化利用率[13]。李大彪等[14]研究发现，当PEG 的添加量为单宁的2 倍时可以降低瘤胃中总细菌和总厌氧真菌的数量。据报道，多糖、多酚相互作用可以能够增强多酚的抗氧化性能、预防心血管疾病、抑菌等功能特性[15]。槲皮素与壳聚糖通过共价结合形成的复合物，可增强多酚对单增李斯特菌、大肠杆菌等食源性致病菌的生长抑制作用[16]。将香蕉缩合单宁接枝到菊粉上，合成的复合物可以增强菊粉的降糖作用，复合物的自由基清除能力和还原能力明显强于菊粉[17]。因此，我们推测菊粉和单宁的复合物可能会产生协同作用而更加有利于动物健康。但是，截至目前，菊粉和单宁的研究主要集中在小鼠以及单胃动物上，在反刍动物上的研究较少，而且大多数试验均是集中在单一物质上的研究，有关单宁与菊粉对绵羊瘤胃微生物的研究未见报道。因此，本试验在前期体外产气试验的基础上，分析饲粮中添加菊粉和单宁对湖羊瘤胃挥发性脂肪酸和瘤胃微生物的影响，以期为菊粉和单宁在湖羊生产实践中提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验羊只和分组

采用单因素试验设计。从甘肃省白银康瑞种羊养殖有限公司选取体况良好、体重相近的断奶湖羊公羔24只，随机分成4组（对照组、试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组），每组6只，设6个重复，进行饲养试验。4组羔羊饲喂相同基础饲粮（DM），试验组分别在DM 中添加0.1%菊粉、0.1%菊粉+2%单宁、0.1%菊粉+2%单宁+4% PEG。试验期共75 d，其中预试期15 d，正试期60 d。于试验结束后进行屠宰，采集瘤胃内容物，用于瘤胃挥发性脂肪酸测定和瘤胃微生物16S rDNA测定分析。

1.2 基础饲粮及营养水平

基础饲粮参照我国《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004）设计，详见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.3 饲养管理

试验动物统一驱虫和免疫后单笼饲养，每天饲喂两次（08：00 和17：00），自由饮水。羊舍环境条件及饲养管理各组保持一致。

1.4 样品采集

试验期结束后，屠宰24只试验羊，从腹腔中快速取出瘤胃，之后从瘤胃的不同部位取样，混合均匀后，取大约200 mL 瘤胃液，再用四层纱布过滤，分装在4 个50 mL 离心管中，迅速置入液氮罐中冷冻。带回实验室后，转移至-80 ℃冰箱中保存，分别用于挥发性脂肪酸测定及瘤胃微生物分析。

1.5 测定方法

1.5.1 瘤胃挥发性脂肪酸（Volatile fatty acids，VFA）测定

按照Liang 等[18]的方法对样品进行前处理，采用美国安捷伦（Agilent）6890N 型气相色谱仪进行测定瘤胃挥发性脂肪酸的含量。

1.5.2 瘤胃细菌16S rRNA测定

微生物信息学分析通过上海派森诺生物科技股份有限公司提供的派森诺基因云平台进行分析。采集4组瘤胃液样品并提取样品总DNA后，根据全长引物序列合成带有Barcode 的特异引物（341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3'）扩增16S rRNA 的V3～V4 区，并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（SMRT Bell）。测序文库质检合格后，利用Illumina MiSeq/NovaSeq 测序平台进行测序。利用Vsearch 软件对序列进行操作分类单元OTU 聚类，用QⅡME2 软件对OTU 进行物种注释及丰度统计，绘制稀释曲线并分析Alpha 多样性，使用PCoA 分析法分析Beta 多样性，然后在门和属分类水平上，统计样品的物种丰度和多样性。

1.6 数据处理

试验数据采用Excel 进行初步整理统计，然后用SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析，采用Duncan’s法对所测得的数据进行多重比较，分析结果用“平均值±标准差”表示。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 菊粉和单宁对湖羊瘤胃挥发性脂肪酸含量的影响

由表2可知，试验Ⅲ组中异丁酸含量显著低于对照组和试验Ⅰ、Ⅱ组（P＜0.05），而试验Ⅱ组中乙酸/丙酸值显著高于对照组（P＜0.05），而其他挥发性脂肪酸在各试验组之间差异不显著（P＞0.05）。

表2 湖羊瘤胃挥发性脂肪酸含量

2.2 菊粉和单宁对湖羊瘤胃微生物的影响

2.2.1 Alpha多样性分析

通过对断奶湖羊瘤胃内容物样品进行16S rRNA V3～V4 区测序，共获得1 592 728 Reads 对。经双端拼接，过滤后产生1 212 455条Cleantags，平均序列长度为400 bp，去除嵌合体和singletonsASVs 后共产生870 408 条高质量序列，每个样品平均产生36 267 条高质量序列。使用QⅡME2 软件对所有样品高质量序列在97.0%的相似度水平下进行聚类，共得到27 772个OTU。

样品Alpha多样性指数稀释曲线见图1-A。如图1-A 所示，当测序数据量在17 000 以上时，稀释曲线基本趋于平缓，根据稀释曲线显示，样本曲线几乎达到了平台期，表明测序深度可靠，能真实反映该样本中大多数微生物的组成情况，可以进行微生物多样性分析。

图1 瘤胃微生物多样性分析

由Venn图分析显示，在所有样本的27 772个OTU中，对照组有12 379 个OTU，试验Ⅰ组有9 379 个OTU，试验Ⅱ组有9 402 个OTU，试验Ⅲ组有9 303 个OTU，4个处理组共享的OTU 数目为1 601个，占OTU总数的5.77%。对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组独有的OTU 数量分别为7 768、4 148、4 181 和4 239个，分别占OTU总数的28.01%、14.96%、15.07%和15.28%（图1-B）。

在日粮中添加菊粉和单宁对湖羊瘤胃内容物微生物Alpha 多样性的影响见表3。由表3 可知，各组间辛普森指数和香农指数差异均不显著（P＞0.05），说明单独添加菊粉或是菊粉与单宁组合添加对瘤胃细菌多样性的影响效果不明显；物种丰度指数Chao1 指数为2 469～3 555，Observed_species 指数为2 201～2 970，对照组Chao1 指数和Observed_species 指数与试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组差异显著（P＜0.05），说明菊粉和单宁的添加会对瘤胃细菌群落的丰富度造成一定影响。

表3 Alpha多样性分析结果

2.2.2 Beta多样性分析

瘤胃液样品细菌OTU 的PCoA 聚类分析见图2。由图2可知，对照组与试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间瘤胃微生物是存在差异的，且组间差异大于组内差异。

图2 瘤胃细菌群落结构的PCoA图

2.2.3 瘤胃微生物群落分析

2.2.3.1 菊粉和单宁对湖羊瘤胃细菌分类学组成和群落结构（门水平）的影响

不同处理组瘤胃细菌在门水平的分布如图3 所示，各组中检测到丰度较高的菌门主要有拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和螺旋菌门等，且不同处理组之间存在一定的差异。各处理组的优势菌门均为拟杆菌门和厚壁菌门，两者相对丰度占比达到95%以上。由表4可知，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中瘤胃中拟杆菌门和变形菌门的相对丰度均显著高于对照组（P＜0.05），并且瘤胃中厚壁菌门、螺旋体门和纤维杆菌门的相对丰度显著降低（P＜0.05）；试验Ⅰ组和试验Ⅱ组瘤胃中髌骨细菌门的相对丰度均显著高于试验Ⅲ组和对照组（P＜0.05）；试验Ⅰ组中广古菌门的相对丰度高于试验Ⅱ组和试验Ⅲ组（P=0.057），但与对照组无显著性差异（P＞0.05）。试验Ⅱ组中放线菌门和软壁菌门的相对丰度显著高于试验Ⅲ组，且与对照组和试验Ⅰ组无显著性差异（P＞0.05）。

表4 门水平上瘤胃微生物相对丰度（%）

图3 门水平上瘤胃微生物相对丰度

2.2.3.2 菊粉和单宁对湖羊瘤胃细菌分类学组成和群落结构（属水平）的影响

如图4 所示，在属水平上，对照组的优势菌属依次为理研菌科RC9 菌属、瘤胃球菌科NK4A214 菌属和克里斯藤森菌科R-7 菌属，3 个试验处理组均以理研菌科RC9 菌属、未分类的F082 和瘤胃球菌科NK4A214菌属为优势菌属。由表5可知，与对照组相比，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3 个组瘤胃中克里斯藤森菌科R-7菌属的相对丰度显著降低（P＜0.05），试验Ⅱ组和试验Ⅲ组增加了瘤胃中理研菌科RC9 菌属的相对丰度均显著高于对照组（P＜0.05）。试验Ⅲ组中未分类的F082的相对丰度显著高于对照组（P＜0.05），且与试验Ⅰ组和试验Ⅱ组无显著差异（P＞0.05）。试验Ⅱ组和试验Ⅲ组显著降低了瘤胃球菌科NK4A214菌属的相对丰度（P＜0.05）。其他菌属的相对丰度在各组之间均无显著性差异（P＞0.05）。

表5 属水平上瘤胃微生物相对丰度（%）

图4 属水平上瘤胃微生物相对丰度（%）

2.2.4 瘤胃菌群显著性差异分析

对4组湖羊瘤胃微生物进行LEfSe差异分析。线性判别分析（LDA）值分布柱状图（仅显示了LDA值大于4 的物种），用来评估组间具有显著差异的物种的影响力。其中对照组中富集的主要微生物有梭状芽胞杆菌、梭菌目、厚壁菌门、克里斯滕森菌科、克里斯滕森菌科R-7菌属、疣微菌科、毛螺菌科、螺旋体目和其他相对丰度较小的一些物种。试验Ⅰ组中富集的主要微生物有韦荣氏菌科，试验Ⅱ组中富集的主要微生物有理研菌科RC9 菌属、理研菌科、试验Ⅲ组中富集的主要微生物有拟杆菌目、拟杆菌纲、拟杆菌门（见图5）。

图5 LDA值分布柱状图

3 讨论

3.1 菊粉和单宁对湖羊瘤胃液挥发性脂肪酸含量的影响

挥发性脂肪酸是碳水化合物在瘤胃中发酵所产生的主要物质，能够反映瘤胃发酵性能以及对营养物质的消化吸收能力[19]。有研究发现，功能性寡糖对瘤胃挥发性脂肪酸含量造成不同程度的影响[20]。在本试验中，TVFA含量在各组之间均无显著性差异，其原因可能是菊粉的添加量较低，不能够对瘤胃微生物的发酵造成影响。另外，菊粉和单宁混合添加试验Ⅱ组中乙丙比含量显著高于对照组，而单独添加菊粉的试验组对乙丙比含量的影响不大。郭婷婷等[21]通过试验发现，在泌乳早期奶牛饲粮中添加60 g/头甘露寡糖可以提高VFA产量，其中乙酸含量变化明显，丙酸、丁酸的含量有增加的趋势，但是变化不明显。这与本试验所得出的结果不完全相同。此外有研究发现，甘露寡糖和大豆寡糖可以使乙酸和丙酸的比例增加，而果寡糖则可以使其比例降低[22]。说明不同种类的功能性寡糖对瘤胃微生物发酵的影响作用不同。

3.2 菊粉和单宁对湖羊瘤胃细菌的影响

3.2.1 菊粉和单宁对湖羊瘤胃细菌群落组成、丰富度和多样性的影响

16S rRNA测序可以对瘤胃微生物群落分类组成进行鉴定和量化[23]。本研究通过IlluminaMiSeq 高通量测序来研究在断奶湖羊日粮中添加菊粉和单宁对湖羊瘤胃微生物区系的影响。微生物Alpha多样性分析中，Chao1指数和Observed species 指数是表示微生物群落相对丰度的重要指标，与微生物的相对丰度之间呈正比例关系；而香农和辛普森指数则表示微生物群落的多样性，香农指数越大，辛普森指数越小，则说明样品中菌群多样性就越高。在本试验中，菊粉、单宁以及PEG 的添加减少了湖羊瘤胃细菌的OTU 数目以及菌群多样性和丰富度，这与张振宁[24]的研究结果基本一致。另外研究表明，单宁对动物胃肠道微生物具有广谱抑制性，会破坏瘤胃细菌的菌膜组织，从而减少瘤胃微生物的数量，降低微生物对硫的利用效率，影响微生物的正常繁殖和瘤胃的发酵功能，导致饲料中营养成分的消化率下降[25]。这也可能是本试验瘤胃中Chao1 指数和Observed species 指数降低的原因之一，具体原因有待进一步研究。

3.2.2 菊粉和单宁对湖羊瘤胃细菌群落相对丰度的影响

反刍动物的瘤胃是一个十分复杂的厌氧微生物发酵系统，主要包括细菌、古菌、原虫、真菌以及噬菌体，其中细菌是含量最丰富多样、代谢最活跃的一类微生物，根据其代谢功能，可将其分为纤维降解菌、蛋白降解菌、淀粉降解菌、脂肪降解菌、乳酸产生菌和乳酸利用菌等[26]。细菌的生长代谢除了能为反刍动物提供能量、蛋白质、必需氨基酸等营养物质以外，还可以降解纤维物质，使其转化为供机体吸收利用的能源物质，进而维持反刍动物的营养需要[27]。大量的研究发现，反刍动物瘤胃中主要以拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌群，其在瘤胃发酵过程中起到很重要的作用[28]。井龙晖[29]通过奶牛静脉注射脂多糖的试验发现，瘤胃中拟杆菌门的相对丰度最高，其次是厚壁菌门，两者共占16SrRNA 序列分析的93.6%。韦玥瑞等[30]通过研究不同饲粮类型对内蒙古绒山羊瘤胃细菌多样性及菌群结构的影响发现，各处理组中门水平的最优势菌为拟杆菌门（72.63%～80.69%），次优势菌为厚壁菌门（15.00%～23.27%）。在本试验中，瘤胃中优势菌群按照相对丰度的大小依次为拟杆菌门、厚壁菌门及变形菌门。拟杆菌门是反刍动物瘤胃中的第一大优势菌群，主要分解饲料中的蛋白质和多种碳水化合物（包括果胶、木糖、低聚糖以及纤维素等），具有维持动物胃肠道正常生理功能和微生物平衡的作用，在动物生长发育及健康方面存在重要意义[31]。本研究发现，在湖羊日粮中添加菊粉、单宁以及PEG 后，其拟杆菌门的相对丰度呈线性增加的趋势，且差异显著。厚壁菌门作为第二优势菌群，其主要功能是参与纤维素、半纤维素、淀粉和寡糖的降解[32]。Turnbaugh 等[33]研究发现，肠道中厚壁菌门含量高的小鼠比较肥胖，而拟杆菌门含量占比高的小鼠却相对较瘦。其原因可能是厚壁菌门中含有较为丰富的淀粉、半乳糖以及丁酸等代谢酶，可以促进动物机体对能量的吸收，从而有利于促进脂肪的沉积[34]。Chiara 等[35]研究表明，菊粉和抗性淀粉可增加肠道中拟杆菌门的相对丰度，而降低了厚壁菌门的相对丰度。这一结果与本试验结果基本一致。在本研究中变形菌门是第三优势菌属，但其所占比例远低于拟杆菌门和厚壁菌门。它是细菌域中最大的一门，其包含很多的致病菌（如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺菌等），容易引起动物腹泻等疾病[36]。在本试验中添加菊粉、单宁以及PEG 后，变形菌门的相对丰度显著增加，说明在日粮中添加菊粉和单宁可能有增加瘤胃中有害菌群的风险。此外，在本试验中，虽然0.1%菊粉组中互养菌门的相对丰度与对照组相比差异不显著，但在数值上有所增加。互养菌门属于革兰氏阴性厌氧杆菌，是一种较新的分类门，对降解丙酮酸和氨基酸具有一定的作用[37]。放线菌门能产生结构比较复杂的抗生素、酶制剂以及抗菌物质等代谢产物，对调节宿主肠道微生态平衡起到重要作用[38]。冶文兴等[39]研究发现在哺乳期犊牛的开食料中添加5 g 甘露寡糖可以显著降低放线菌门的相对丰度，在本试验中，0.1%菊粉和2%单宁组可以增加放线菌门的相对丰度，这可能与动物种类等不同有关。

在属水平上，理研菌科RC9菌属、F082、瘤胃球菌科NK4A214 菌属和克里斯藤森菌科R-7 菌属等为湖羊瘤胃优势菌群。这与大部分的研究结果存在一定的差异。在本研究中，湖羊瘤胃的优势菌属中还出现了未注释菌属—F082，有研究发现，不同品种的反刍动物瘤胃内微生物多样性存在较大差异[40]。这可能是由于湖羊具有其独特的瘤胃微生物生态系统。Zhong 等[41]研究发现，普雷沃氏菌属_1 在山羊瘤胃中占主导地位，其含量高达42.87%。Iqbal 等[42]发现，普雷沃氏菌属在水牛和泽西牛优势菌属中的相对丰度最高，分别在25%和50%以上。以上研究表明大多数反刍动物瘤胃微生物的优势菌属为普雷沃氏菌属，其具有遗传多样性丰富、底物宽泛、微生物种类多等特点[43]，这与本试验结果不一致。在本试验中，优势菌属为理研菌科RC9 菌属和未注释的F082，两者均属于拟杆菌门，其试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的相对丰度较对照组相比显著增加，而理研菌科RC9菌属有助于琥珀酸和丙酸的产生，这也就解释了丙酸含量在数值上有所增加的原因。普雷沃氏菌属在各组间均无显著性差异，其相对丰度仅为（4.059%～6.621%）。马秀花等[44]测定滩羊瘤胃菌群组成时发现，普雷沃氏菌属丰度仅为5%，日粮中甘露寡糖的含量会影响其菌属丰度；这与本试验结果基本相似。瘤胃球菌科NK4A214菌素包括黄化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，是瘤胃中主要的纤维降解菌，通过产生大量复杂的复合酶体（主要为木聚糖酶）降解植物饲料中的纤维素和半纤维素[45]。金鹿等[46]在研究沙蒿多糖组合制剂对滩羊羔羊瘤胃菌群多样性的影响中发现，沙蒿多糖+包被丁酸钠组和沙蒿多糖+莫能菌素组能显著降低了革兰氏阳性纤维溶解菌（如瘤胃球菌属）在瘤胃液中的相对丰度。在本研究中，0.1%菊粉和2%单宁组、0.1%菊粉和2%单宁以及4%PEG组瘤胃液中瘤胃球菌科NK4A214菌属的相对丰度显著低于对照组（P＜0.05），这可能是由于湖羊瘤胃内瘤胃球菌科NK4A214菌属的生长因添加菊粉和单宁而受到限制，从而导致其他瘤胃球菌科的相对丰度降低，具体机理还需进一步探究。

4 结论

饲粮中添加菊粉和单宁会对湖羊瘤胃微生物多样性及组成产生一定影响，可以提高乙酸/丙酸值，改变瘤胃发酵类型；瘤胃微生物中厚壁菌门和拟杆菌门始终为优势菌门，各个试验处理组均可以影响瘤胃菌群结构，有利于改善肠道健康、调节菌群结构。并且菊粉和单宁共同添加的效果优于菊粉单独添加。