mNGS技术和血清G试验在判断耶氏肺孢子菌感染与定植中的价值及二者相关性研究

张彩霞，刘新年，杜川，王新卫

耶氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia，PJP）是由耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii，PJ）引起的人类呼吸系统机会性感染，多发生于免疫功能低下者。由于PJ不能在体外培养基生长，故目前确诊PJP仍是通过染色镜检发现呼吸道标本特征性的包囊或滋养体为主，但传统的染色方法灵敏度不高，使得大部分PJP患者不能得以准确、快速确诊[1]。因此，还需结合临床表现以及其他检测方法。目前，多项研究显示血清1，3-β-D葡聚糖定量检测（G试验）[2-6]可辅助诊断PJP，且数值的高低可鉴别PJ定植和感染，数值越高，感染可能性越大，但鉴别二者的截断值尚无定论。另外，随着宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）技术兴起，由于该技术具有广覆盖、迅速高敏、无偏倚性的特点，已被广泛应用于疑难、危重、特殊病原体检测[7-9]及感染性疾病诊断中[10-12]，因此提高了PJP的诊断率。尽管mNGS应用前景广阔，但仍存在无法明确背景菌、污染菌、定植菌、致病菌等情况，尤其PJ可以共生或以正常菌群的形式定植于人体呼吸道，故当mNGS检出PJ序列时，那么其是定植还是感染呢？其有无合适的截断值予以判断呢？本研究拟通过比较PJ感染者与定植者的临床特点以及血清G试验、肺泡灌洗液mNGS序列数的差异，从而探讨肺泡灌洗液mNGS技术、血清G试验在判断PJ感染与定植中的价值以及二者相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 对2018年9月至2022年5月在江汉大学附属湖北省第三人民医院收治住院治疗且行肺泡灌洗液mNGS技术检出PJ序列数的40例肺部感染患者的病例资料进行回顾性分析。根据mNGS检出PJ是否抗PJ治疗分为两组：PJ感染组（mNGS检出PJ，抗PJ治疗有效者）21例，PJ定植组（mNGS检出PJ，未抗PJ治疗好转出院者）19例。PJP诊断标准：（1）临床表现为咳嗽、发热、呼吸困难、进行性缺氧等；（2）影像学表现为多发性结节、多发斑片影或实变影、磨玻璃样改变或肺间质弥漫浸润病变等；（3）mNGS检出PJ序列；（4）由两位及以上具有高级职称且经验丰富的医生共同诊断；（5）抗PJ治疗有效。两组排除标准：（1）年龄<18岁；（2）无肺部感染及病原学证据；（3）mNGS前行经验性抗PJ治疗者；（4）肺部真菌感染者，严重心脏疾病及严重心律失常者，近1个月发生心脑血管事件者，严重精神心理性疾病及无行为能力不能配合完成肺泡灌洗液mNGS检查者等；（5）临床资料不完整；（6）后期随访不符合诊断者。本研究通过江汉大学附属湖北省第三人民医院伦理委员会审批（2022伦审科第009号）。

1.2 方法

1.2.1 临床资料 收集患者一般资料包括性别、年龄、体质指数（BMI）、吸烟史（定义：近1年内平均至少吸烟1支/d）、基础疾病及用药史〔慢性肾脏疾病、血液系统疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、实体器官移植、慢性肺部疾病、糖皮质激素/免疫抑制剂使用情况〕，临床症状（发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难、胸痛、咯血），影像学特点（磨玻璃渗出影、间质改变、实变、结节、胸腔积液、囊状），实验室指标〔白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）、乳酸脱氢酶（LDH），动脉血氧分压/吸入氧浓度百分比（PaO2/FiO2）、CD4+T淋巴细胞计数〕，进行血清G试验、半乳甘露聚糖检测（GM试验，用于鉴别真菌感染患者）。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液采集 患者禁水、禁食4 h，2%利多卡因喷雾局部麻醉咽部和鼻腔后，在olympusBF-260型电子支气管镜下采集支气管肺泡灌洗液，按《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识（2017年版）》[13]进行操作，严格遵守无菌原则，灌洗部位根据胸部影像学确定，病变局限者选择病变段，弥漫性病变者选择右肺中叶或左肺上叶舌段。当支气管镜到达目标支气管段或亚段后，将顶端嵌顿在入口处，经操作孔道快速注入37℃ 0.9%氯化钠溶液，总量60～120 ml，分次注入（20～50 m1/次），注入后立即以100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）负压抽吸，回收率40%～60%，回收的灌洗液装入灭菌容器中，一份（≥10 ml）送检进行常规细菌、真菌培养，一份（≥5 ml）行mNGS检测。

1.2.3 mNGS检测方法 支气管肺泡灌洗液干冰保存送至深圳华大基因（mNGS标本的采集、保存和运输严格按照该公司标准化规范执行）行mNGS检测，对样本中微生物核酸序列进行分析，与该公司病原数据库进行比对，得出报告结果序列数，从而对微生物进行鉴定。检测过程包括：核酸提取、RNA逆转录、目标片段化、文库构建、上机测序（测序下机后去除低质量和长度<35 bp的数据以获得高质量的数据）、生物信息分析、报告解读等。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件分析，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，采用Mann-whitney U检验进行组间比较；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验、校正χ2检验或Fisher's确切概率法；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线评估mNGS与血清G试验判断PJ感染与定植的价值，计算ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）、灵敏度、特异度、最佳截断值。采用Spearman秩相关分析mNGS与血清G试验相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料、基础疾病及用药史比较 两组性别、年龄、BMI、吸烟史、基础疾病情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；PJ感染组糖皮质激素/免疫抑制剂使用率较PJ定植组高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 两组患者一般资料、基础疾病及用药史比较Table 1 Comparison of general information，underlying diseases and medication history between two groups

2.2 临床症状及影像学特点比较 PJ感染组与PJ定植组发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难、胸痛、咯血比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）。PJ感染组磨玻璃渗出影、间质改变比例高于PJ定植组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组实变、结节、胸腔积液、囊状比例比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 两组患者临床症状及影像学特点比较〔n（%）〕Table 2 Comparison of clinical symptoms and imaging characteristics between two groups

2.3 实验室指标比较 两组白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、PCT、CRP、LDH、PaO2/FiO2比较，差异无统计学意义（P>0.05）；PJ感染组CD4+T淋巴细胞计数低于PJ定植组，血清G试验、mNGS序列数高于PJ定植组，差异均有统计学意义（P<0.05，表3）。

表3 两组患者实验室指标比较Table 3 Comparison of laboratory indicators between two groups

2.4 mNGS序列数与血清G试验鉴别PJ感染与定植的价值 mNGS序列数与血清G试验鉴别PJ感染与定植的最佳截断值分别为24个、106.7 ng/L，AUC分别为0.95、0.89，灵敏度分别为95.2%、76.2%，特异度分别为78.9%、89.5%（图1、表4）。

表4 mNGS序列数与血清G试验鉴别PJ感染与定植的价值Table 4 Value of the number of sequences of pneumocystis jirovecii detected by mNGS and serum G level measured by serum G test in differentiating pneumocystis jirovecii infection from colonization

图1 mNGS序列数与血清G试验鉴别感染与定植ROC曲线Figure 1 The ROC curve of the number of sequences of pneumocystis jirovecii detected by mNGS and serum G level measured by serum G test in differentiating pneumocystis jirovecii infection from colonization

2.5 血清G试验与mNGS序列数相关性分析Spearman秩相关结果示mNGS检出PJ序列数与血清G试验水平呈正相关（rs=0.769，P<0.001，图2）。

图2 mNGS检出PJ序列数与血清G试验的相关性Figure 2 Correlation between the number of pneumocystis jirovecii sequences detected by mNGS and serum G level measured by serum G test

3 讨论

由于呼吸道PJ定植相当普遍[14-15]，为避免临床过度治疗及延误治疗，识别定植与感染很重要。本回顾性研究通过比较PJ感染与定植不同之处，以期能为临床鉴定感染与定植提供依据。

在一般资料、基础疾病、用药史方面，本研究发现19例PJ定植组和21例PJ感染组绝大多数来自免疫缺陷患者如HIV感染、血液系统疾病、恶性肿瘤、实体器官移植、自身免疫性疾病、长期使用糖皮质激素/免疫抑制剂者等，部分来自慢性肺部疾病，另外定植组尚可见于免疫功能正常人群。因此，PJ感染或定植除需重点关注免疫抑制个体人群外，尚需关注慢性肺部疾病。BABIC-ERCEG 等[16]及LOWE等[17]的研究亦提示PJ感染或定植与慢性阻塞性肺疾病、肺囊性纤维化以及间质性肺炎等多种呼吸系统疾病密切相关。可见，慢性肺部疾病在PJ感染或定植中亦扮演一定角色。同时，本研究发现PJ感染组约52.4%患者接受过糖皮质激素/免疫抑制剂治疗，而PJ定植组19例中仅有1例使用过糖皮质激素/免疫抑制剂，提示长期应用此类药物可能是PJ感染的高危因素。因此，当存在上述基础疾病，尤其接受糖皮质激素/免疫抑制剂治疗的患者应该警惕PJP的发生。

在临床表现方面，本研究发现PJ感染组与定植组在临床症状如发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难、胸痛、咯血等症状间并无明显差异，提示通过临床症状无法区分二者。近年来，临床上常用肺部影像学改变、血液中CD4+T淋巴细胞计数、血清G试验、LDH等[18-19]指标辅助诊断或预测PJP。本研究发现PJ感染组典型磨玻璃渗出影、间质改变高于PJ定植组，但两组影像学特点如实变、结节、胸腔积液、囊状改变间比较无统计学差异。同时，本研究中两组LDH并无差异性，与ESTEVES等[2]研究一致，提示靠LDH无法鉴别定植与感染，分析原因可能为LDH升高更多反映的是肺组织损伤的严重程度，不具特异性。但血清G试验PJ感染组明显高于定植组，与LIU等[20]研究一致，分析原因可能与当PJ感染后经肺泡巨噬细胞吞噬、消化，1，3-β-D葡聚糖从胞壁中释放入血有关。另本研究发现PJ感染组CD4+T淋巴细胞计数明显低于定植组，几乎所有PJP患者的外周血CD4+T淋巴细胞计数<200个/μl，而且发现此部分患者mNGS检出PJ序列数明显高于定植组。因此，对于某些免疫功能低下的患者，在治疗过程中需密切监测CD4+T淋巴细胞计数，一旦CD4+T淋巴细胞数呈下降趋势时，需警惕PJ感染，此时可结合影像学、血清G试验、mNGS检查来判断。

鉴于多项研究[4-6]显示血清G试验对于诊断PJP以及判断治疗效果有一定的价值。而DAMIANI等[21]人发现，实时荧光定量PCR可以根据PJ序列数不同来区分PJ感染或定植，但是序列数的临界值很难确定。基于此，是否可以根据mNGS检出PJ序列数及血清G试验来区分PJ感染和定植呢，其鉴别二者的临界值又如何呢。本研究以临床最终诊断PJP感染与定植为“金标准”，发现mNGS序列数与血清G试验鉴别感染与定植的最佳截断值分别为24个、106.7 ng/L，AUC分别为0.95、0.89，灵敏度分别为95.2%、76.2%，特异度分别为78.9%、89.5%。同时，本研究分析了血清G试验与mNGS检出PJ序列数相关性，以期了解血清G试验与PJ负荷是否相关。本研究发现mNGS检出PJ序列数与血清G试验水平呈正相关，与JIANG等[22]研究一致，但与HELD等[23]和LIU等[20]的研究不同，他们认为血清G试验与PJ负荷并不相关。分析造成差异的原因可能为：1，3-β-D葡聚糖并非PJ特异性标志物，且各研究间纳入分组标准及样本量不同。因此，本研究提示血清G试验与mNGS除可以辅助诊断PJP外，尚可将PJ感染与定植区分，当血清G试验水平≥106.7 ng/L、mNGS检出PJ序列数≥24个时，诊断PJ感染价值较大，mNGS检出PJ序列数与血清G试验水平呈正相关。

PJ定植相当普遍，临床上如何鉴别定植与感染是一大难题，本研究通过比较PJ感染者与定植者间临床特点、血清G试验、肺泡灌洗液mNGS序列数的差异，从而探索血清G试验及肺泡灌洗液mNGS序列数判断PJ感染与定植的价值，并求得截断值，为临床判断定植与感染提供了帮助，避免过度治疗及延误治疗。但本研究亦存在一定局限性：（1）mNGS报告的解读，尚无统一标准，尽管本研究尝试了判断PJ感染与定植的mNGS序列数截断值，但由于受样本量小的局限，未动态监测血清G试验与mNGS中PJ序列数变化以了解其对评估治疗疗效有无价值。今后需扩大样本量，进行多中心前瞻性研究进一步验证。（2）对于判断PJ感染与定植，无标准的诊断参数，本研究以是否抗PJ治疗有效且经随访确认，故可能存在一定选择偏倚。

综上，考虑鉴别PJ感染与定植的模型可能包含：（1）免疫缺陷，尤其糖皮质激素/免疫抑制剂使用；（2）影像学表现为典型磨玻璃渗出影、间质改变；（3）外周血CD4+T淋巴细胞计数降低，尤其<200个/μl；（4）血清G试验升高；（5）mNGS检出PJ序列数。血清G试验及mNGS检出PJ序列数数值越高，感染可能性越大，血清G试验与PJ负荷呈正相关。今后研究方向：扩大样本量，动态监测血清G试验与mNGS中PJ序列数变化，了解其对评估治疗疗效有无价值。

作者贡献：张彩霞进行文章的构思与设计，文章的可行性分析，文献及资料收集、整理，撰写论文；刘新年进行论文的修订；杜川协助采集数据、分析数据；王新卫负责文章的质量控制及审校，技术支持，对文章整体负责。

本文无利益冲突。