回旋灸对压力性损伤大鼠创面组织超微结构的影响

于杰，李洪玲，赵钢，李金贵

在新型冠状病毒感染疫情中，医护人员由于长时间佩戴口罩易导致颜面部出现压疮，美国国家压疮咨询委员会（National Pressure Ulcer Advisory Panel，NPUAP）将其定义为器械相关压力性损伤（device related pressure injuries，DRPI），本病多由于固定装置及呼吸设备等器械的压力、潮湿状态及器械的材质致使皮肤及皮下组织出现损伤，多见于医护人员的职业损伤及ICU病房患者[1-6]。压疮（又称褥疮、席疮）对应现代医学压力性损伤[2-5]，是由于局部组织长期受压，继而发生持续缺血、缺氧以及营养不良，导致组织发生溃烂、坏死的外科疾病。《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[7]并发症防治部分新增加了压疮内容，压疮作为脑卒中并发症具有高发病率的特点已达成共识，应当引起广泛关注和重视，其有效防治及机制亟待深入研究。压疮创面修复早期存在炎性细胞过度持续浸润，致使创面由炎症期向增殖期发展受阻是影响压疮修复的重要因素，新生血管的生成在压疮修复过程中具有关键作用。艾灸治疗压疮其临床效果显著[8-16]，但机制不清，项目组近年来对艾灸促进压力性损伤组织血管新生的机制进行了研究[17-21]。本研究采用透射电镜观察回旋灸对压力性损伤皮肤组织超微结构的影响，明确回旋灸促进压力性损伤组织创面修复的作用，旨在为回旋灸治疗压力性损伤提供理论依据和参考方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究时间 2020年12月至2021年11月。

1.1.2 实验动物 120只雌性健康Sprague-Dawly（SD）成年大鼠，购自扬州大学，实验动物生产许可证编号：SCXK（苏）2017-0007，体质量225～235 g 。大鼠在温度（19.0±2.1） ℃、相对湿度（RH）40%～50% 、明暗周期12 h的环境中适应性喂养2周后建立压力性损伤大鼠模型，期间使其自由进食、饮水、活动。实验全程单笼饲养大鼠，本研究通过扬州大学实验动物伦理审查，编号：2020-FSYY-12。

1.1.3 实验仪器设备 红外热像仪（美国FLIR SC640，FLIR SYSTEM），电子天平（上海精密仪器厂，MP200A型），透射电镜（日本日立，H-7650 ），切片机（Reichert），小动物麻醉机（Matrx VMR，北京益仁恒业科技有限公司），自制造模装置〔有机玻璃板（厚度15 mm）、塑料制尼龙扎带、不锈钢丝网、水瓶底座、十字形托盘、502胶水、钢珠、膨胀螺丝及帆布条〕。

1.1.4 实验试剂 锇酸、戊二醛溶液、磷酸盐缓冲液、丙酮及环氧树脂812（上海富宇），异氟烷麻醉剂（山东科源制药有限公司），0.9%氯化钠溶液（青岛华仁药业股份有限公司），五年陈艾（规格：18 mm×200 mm的有烟艾条，南阳药益宝艾草制品有限公司），75%乙醇、医用碘伏，敏感肌肤型脱毛膏（薇婷牌，利洁时家化中国有限公司）及医用棉签。

1.2 实验方法

1.2.1 构建压力性损伤大鼠模型 采用自制装置通过塑料制尼龙扎带依次对大鼠7个部位（双侧腋下、腹部、双侧腹股沟内侧及双踝部）进行固定，确保待造模部位充分暴露，备皮处理（面积20 mm×20 mm），后使用碘伏对待造模部位和装置螺钉锥度侧进行消毒。将自制装置固定于实验大鼠腿部近膝关节骨隆突处（造模部位），通过缺血-再灌注损伤循环周期模式制备压力性损伤大鼠模型。缺血期（120 min）+再灌注期（30 min）=1个循环，5个循环/d，共持续3 d。再灌注期（30 min）内需将全部大鼠解压松绑，放至鼠笼自由饮水、进食及活动。造模3 d结束后，再持续1 d（观察期），目的是用以评价压力性损伤大鼠模型制备是否成功，对于造模失败的动物模型，给予剔除处理[17-20]。

1.2.2 动物模型的评价 大鼠模型评价参照2016年NPUAP指南[2]和2019年最新指南NPIAP/EPUAP压力性损伤分类系统2～3期[3-5]，造模全程密切观察SD大鼠行为学变化（整体状态、步态、性情及二便等）及创面肉眼观察（创面颜色、形态、渗出物性质及结痂情况）的改变[22]。

1.2.3 实验分组 严格遵循先造模后随机的原则，将85只SD大鼠施以压力性损伤缺血-再灌注模型制备，期间共有7只大鼠造模失败、8只大鼠于造模过程中死亡。将最终模型制备成功的70只SD大鼠通过随机数字表法分为回旋灸组（n=35）与模型对照组（n=35），另外选取35只健康SD大鼠作为空白对照组。每组再根据干预时间分为5个亚组，即1、3、5、7、10 d 5个亚组，每亚组各7只。造模后至干预治疗过程中，模型对照组和回旋灸组各有5只SD大鼠脱落，空白对照组有5只SD大鼠在备皮处理时不慎出现副损伤，予剔除。

1.2.4 干预措施 三组SD大鼠采用统一的捆绑方式。（1）回旋灸组：先对创面施以碘伏处理，再予回旋灸操作，以其压力性损伤创面为中心，10 mm长度为移动半径，1次/d，每次持续15 min。通过红外热像仪及实验大鼠的状态、反应和操作者手部的温感及时调整艾条燃烧端与创面的距离，使红外热像仪检测创面皮肤表面温度值控制在40～42 ℃，每5 s测量1次创面皮肤表面的温度，全程施灸操作务必注意对灰烬（艾条燃烧过程中产生）及时处理。（2）模型对照组：造模后只对创面施以常规碘伏处理。（3）空白对照组：不予造模，仅对模拟造模部位处施以碘伏处理。分别于干预的1、3、5、7、10 d对各亚组大鼠取样进行透射电镜观察。

1.2.5 透射电镜观察

1.2.5.1 取材前准备 将磷酸盐缓冲液（PBS溶液）、2.5%戊二醛固定液、所需器械（蜡板、手术刀片、一次性注射器、眼科手术剪、EP管及镊子等）均放置于4 ℃冰箱内预冷处理。

1.2.5.2 取材步骤 （1）通过塑料制尼龙扎带依次对SD大鼠7个部位（双侧腋下、腹部、双侧腹股沟内侧及双踝部）固定于不锈钢丝网上，开启小动物麻醉机和氧气瓶，吸入异氟烷和氧气麻醉实验大鼠，约30 s后待实验大鼠进入麻醉状态，此时将异氟烷的持续吸入量降低至最小剂量。麻醉期间应确保异氟烷剂量有效、适中、平稳。待其进入麻醉状态后，将压力性损伤局部创面充分暴露，可在创面周围通过记号笔做出标记，将预冷的2.5%戊二醛固定液通过1 ml注射器注入EP管中，同时将少许2.5%戊二醛固定液滴入预冷的蜡板中，等待取材。（2）选取压力性损伤大鼠创面皮肤的正中部位，通过眼科手术剪进行取材，注意下刀快速、准确，以确保取材组织新鲜。（3）将取材后的皮肤组织在离体后迅速经过PBS溶液和0.9%氯化钠溶液彻底冲洗。（4）将经过冲洗的大鼠皮肤组织放置于具有2.5%戊二醛固定液的蜡板中，采用双刀片拉锯的方法将组织切成体积不超过1 mm3的小块组织，切块须快速，切块时确保组织浸没在固定液中。用小号镊子轻轻将切好的组织移送至装有2.5%戊二醛固定液的EP管中，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2.5.3 透射电镜制片 （1）前固定：2.5%戊二醛溶液中固定标本180 min，4 ℃保存。（2）PBS溶液漂洗：0.1 mol/L PBS溶液漂洗，15 min/次，共进行3次。（3）后固定：1%锇酸固定液固定120 min。（4）PBS溶液漂洗：0.1 mol/L PBS溶液漂洗，15 min/次，共进行3次。（5）梯度脱水：室温下50%丙酮15 min→70%丙酮15 min→80%丙酮15 min→90%丙酮15 min→100%丙酮15 min，进行3次。（6）浸透、包埋、固化：纯丙酮+包埋液（2∶1）于室温180 min→纯丙酮+包埋液（1∶2）于室温过夜→纯包埋液于37 ℃ 120～180 min→在37 ℃烤箱内过夜→在45 ℃烤箱内0.5 d→在60 ℃烤箱内1 d。用牙签轻轻将已渗透完毕的样品移送至包埋板中，在45 ℃给予树脂包埋0.5 d。（7）超薄切片：用超薄切片机切片，厚度保持50 nm左右，载网。（8）染色：分别进行醋酸铀、枸橼酸铅的双重染色。（9）透射电镜下观察各亚组大鼠皮肤创面的超微结构。

2 结果

2.1 空白对照组电镜结果 空白对照组1、3、5、7、10 d各亚组大鼠皮肤组织电镜下超微结构所示，基底细胞、棘细胞的线粒体结构清晰、数量很多，状态较好且丰富，表皮呈现完整的全层结构，棘细胞的桥粒连接状态很好，线粒体丰富发达，基底细胞的功能活跃，线粒体结构正常，基膜存在，结构尚可，见图1。

图1 空白对照组大鼠压力性损伤创面组织的超微结构Figure 1 The ultrastructure of wound tissue in rats with pressure injury in blank control group

2.2 模型对照组电镜结果 模型对照组1 d亚组大鼠压力性损伤创面组织电镜下可见，绝大部分表皮脱落，少部分表皮呈现萎缩状态，可见大量的炎性细胞浸润，其中以中性粒细胞为主，创面外缘伴有细菌感染，见图2 A～B。模型对照组3 d亚组大鼠压力性损伤创面组织镜下所示，表皮局灶性损伤，可见大量的炎性细胞，伴有结晶体存在，见图2C～D。模型对照组5 d亚组大鼠压力性损伤创面组织镜下所示，表皮部分脱落，部分残存，存在大量的炎性细胞高度浸润，其中以中性粒细胞为主，此时期的中性粒细胞为新鲜状态，见图2E～F。模型对照组7 d亚组大鼠压力性损伤创面组织镜下所示，未见表皮全层结构，基底细胞及棘细胞的线粒体肿胀，数量较少，细胞间隙较宽，可见大量的炎性细胞，以吞噬细胞为主，伴有少量的陈旧性中性粒细胞，见图2G～H。模型对照组10 d亚组大鼠压力性损伤创面组织镜下可见少部分表皮结构完整，大部分未见全层表皮结构，仅存在基底层及棘层，缺失颗粒层、透明层及角质层。基底细胞与棘细胞的线粒体仍呈现肿胀状态，炎性细胞浸润以凋亡的淋巴细胞与吞噬细胞为主，见图2I～J。

图2 模型对照组大鼠不同时间点压力性损伤创面组织的超微结构Figure 2 The ultrastructure of wound tissue in rats with pressure injury in model control group at different time points

2.3 回旋灸组电镜结果 回旋灸组1 d亚组大鼠压力性损伤创面组织镜下超微结构显示，表皮呈局灶性损伤，部分脱落，部分萎缩，真皮层受损，真皮出现大量的炎性细胞浸润（以中性粒细胞为主），见图3 A～B。回旋灸组3 d亚组大鼠压力性损伤创面组织透射电镜下可见，基底细胞部分变性，部分功能尚可，基膜附近存在变性细胞，基底细胞的线粒体肿胀，桥粒连接不清楚，两个基底细胞之间间隙增大，炎性细胞浸润基底细胞层。棘细胞的部分线粒体呈肿胀状态，细胞间隙较宽。表皮的角质层脱落，真皮层有中等量的炎性细胞浸润，与回旋灸组1 d亚组的炎性细胞数量相比，此时期数目相对减少，部分炎性细胞处于凋亡状态，核固缩明显，见图3C～D。回旋灸组5 d亚组大鼠压力性损伤创面组织镜下所示，表皮部分完整，部分缺失，部分仅可见基底层及棘层，颗粒层，透明层与角质层消失，部分可见基底层、棘层、颗粒层、透明层及角质层。绝大部分基底细胞的线粒体状态很好，丰富发达，结构清晰，少部分略有肿胀，桥粒连接状态较好，结构较清晰，基膜清晰可见，棘细胞的部分线粒体肿胀或变性，但桥粒连接尚可，真皮层可见不新鲜的粒细胞浸润，大量的成纤维细胞增生活跃，伴有少量的淋巴细胞，见图3E～F。回旋灸组7 d亚组大鼠压力性损伤创面组织镜下可见完整的表皮全层结构，基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层均清晰可见。绝大部分基底细胞的线粒体结构清楚，数量较多且丰富，棘细胞的线粒体部分肿胀，部分尚可，真皮炎性细胞以吞噬细胞为主，淋巴细胞进入表皮，可见新生的毛囊及皮脂腺，见图3G～H。回旋灸组10 d亚组大鼠压力性损伤创面组织镜下所示，表皮结构完整，可见清晰、完整的表皮全层结构，即基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层。基底细胞的线粒体数量多，丰富，未见肿胀，桥粒形态较好，棘细胞的线粒体更为丰富，结构清晰，桥粒形态较好，炎性细胞以大量的淋巴细胞浸润为主，所见毛囊较为完整，见图3 I～J。

图3 回旋灸组大鼠不同时间点压力性损伤创面组织的超微结构Figure 3 The ultrastructure of wound tissue in rats with pressure injury in circling moxibustion group at different time points

3 讨论

近年来压疮发病率呈持续升高状态[23]，面对压疮易发、难治的特点以及治疗成本昂贵的问题，压疮的有效防治尤为重要，因此寻求安全有效、成本低廉的防治手段曾一度成为医学研究的关注热点[24-25]。从祖国医学特色理论分析，艾灸治疗压力性损伤有的放矢。《医学入门·针灸》载：“药之不及，针之不到，必须灸之。”《灵枢·官能》：“针所不为，灸之所宜。”艾灸行气消瘀，温经通络[26]，回旋灸温热刺激持久，活血温通之力更甚，用于治疗压力性损伤体现了中医学的优势与特色，因此本研究具有鲜明的中医理论支撑。从现代医学研究角度分析，压力性损伤归属于慢性难愈合创面，其修复愈合的过程相对较复杂，原因之一在于与一般的皮肤损伤相比，压力性损伤组织修复过程中的每个阶段均相对较滞后。压疮创面修复的早期存在炎性细胞过度持续浸润，致使创面由炎症期向增殖期发展受阻是影响压疮修复重要因素，新生血管的生成在压疮修复过程中具有关键作用。项目组前期HE染色结果发现，与模型对照组相比，回旋灸组大鼠其压力性损伤组织中的炎性细胞浸润高峰提前，肉芽组织出现时间点亦提前，其成纤维细胞增生程度与数量更明显，且出现时间点较早，回旋灸组大鼠创面组织更早出现新生血管和表皮结构的恢复[18]。

通过透射电镜观察回旋灸对压力性损伤大鼠创面组织超微结构的影响，结果发现，与空白对照组比较，造模后表皮脱落或萎缩，呈缺失或萎缩状态，原有正常皮肤结构发生改变，透射电镜观察的重点在于表皮中的细胞器及炎性细胞状态。与模型对照组比较，回旋灸组对于表皮结构的修复具有明显优势，在治疗5 d后可见表皮结构，部分完整，部分仅可见基底层及棘层，在7 d后可见表皮的完整全层结构，即基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层。而模型对照组在碘伏处理10 d后少部分表皮结构完整，大部分未见全层表皮结构，仅见基底层及棘层，未见颗粒层、透明层、角质层，由此说明回旋灸对压力性损伤大鼠创面组织的表皮修复发挥明显促进作用。同时，回旋灸组组内不同时间点，随着艾灸干预刺激的累积，5、7、10 d三亚组中基底细胞及棘细胞的线粒体的结构、数量、形态由损伤后的肿胀、数量较少、不丰富、结构不清逐渐向修复后的不肿胀、数量较多、丰富、结构清晰的方向发展转变，其中修复因素占主导作用，从而促进压力性损伤创面组织的修复及愈合过程。此时期超微结构的改变可能归因于残存表皮功能状态的改善以及新生表皮存在完整两方面。模型对照组组内不同时间点呈现了压力性损伤创面损伤及经碘伏处理后自身修复中的基本病理状态变化，直至碘伏处理10 d后，基底细胞及棘细胞的线粒体仍呈肿胀、数量较少、不丰富、大而空的形态特点，从损伤出现后经碘伏处理至单纯自身修复的进程比较缓慢，损伤因素占主导作用。此时期线粒体呈肿胀状态考虑为两个原因，一是新生血管形成较为缓慢，不足以供应受损区的营养状态，尤其针对新生组织的营养成分与氧气的提供较为缺乏，导致新生组织的再生相对较缓慢，残存表皮线粒体肿胀，从而阻碍表皮的修复；二是炎性细胞浸润期的延长对表皮的修复具有抑制作用，阻碍表皮的修复，导致其线粒体肿胀。本研究发现在炎性细胞的镜下改变方面，回旋灸组从1 d的大量中性粒细胞浸润，3 d中等量的中性粒细胞，5 d的不新鲜、陈旧性中性粒细胞，7 d吞噬细胞及淋巴细胞，10 d的淋巴细胞，反映出回旋灸治疗后压力性损伤创面组织从急性炎症高度浸润发展至慢性炎症阶段的变化，中性粒细胞从新鲜至陈旧的状态变化。模型对照组在碘伏处理5 d后为急性炎症的高度浸润阶段，模型对照组的炎性细胞浸润期延长。与模型对照组比较，回旋灸组从整体上提前急性炎症浸润的高峰，因而在整体进程上缩短压力性损伤创面修复时间。

综上所述，透射电镜下观察回旋灸对压力性损伤大鼠创面组织超微结构的影响与前期光镜下观察其创面病理形态学改变[18]，二者对于炎性细胞浸润及表皮的观察结果基本一致，由此说明，一方面回旋灸对压力性损伤大鼠创面组织的表皮修复具有明显促进作用。另一方面回旋灸从整体上提前急性炎症浸润的高峰，在整体进程上缩短创面愈合时间，因此回旋灸能够有效促进压力性损伤组织的创面修复。

作者贡献：于杰负责选题，进行研究设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；李洪玲进行研究实施、评估、资料收集；于杰、赵钢进行论文的修订、英文的修订；李金贵进行质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。所有作者确认了论文的最终稿。

本文无利益冲突。