不同维生素对桦褐孔菌生长及三萜类化合物积累的影响1)

邓振 王欣然 谭瑞娜 马玲

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

桦褐孔菌(Inonotusobliquus)，又名白桦茸[1]，是一种应用前景广泛的药用真菌，有效成分主要是三萜类、木质素类、黑色素类、叶酸衍生物等化合物[2]，对糖尿病、高血脂、高血糖等多种疾病具有一定的疗效[3]，且已证实具有安全性高、低毒性的特点，可被用于开发为保健品等[4-5]；由于人工栽培的桦褐孔菌药用价值远不及野生菌株[6]，而桦褐孔菌野外资源十分短缺[7]。目前，如何提高桦褐孔菌活性成分的产量是人工培养过程中的研究热点[8]。朱春玉[9]等人发现桦褐孔菌菌丝体具有和子实体相同的药用价值；Wang et al.[10]发现维生素能够提高桦褐孔菌胞外多糖(EPS)含量。维生素通常以辅酶或辅基的形式参与合成与代谢相关的酶类，促进甲基的形成和转移，促进细胞周围组织中碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢，并参与调节DNA链的合成[11]。研究显示维生素促进灵芝三萜类化合物的合成[12]。研究还发现维生素对滑菇和金针菇具有促生作用[13-14]。真菌在细胞质中以乙酰CoA为原料，通过MVA途径合成三萜[15-16]。在这个过程中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、角鲨烯合酶(SQS)、羊毛甾醇合酶(LS)等是该代谢途径的关键酶[17]。因此，本研究测定了桦褐孔菌培养第10天时B族维生素对桦褐孔菌内的法尼基焦磷酸合酶、角鲨烯合酶的活力影响。

目前，维生素对桦褐孔菌的生长及三萜类化合物积累的影响的研究报道较少，因此本研究通过液态发酵的方式，以桦褐孔菌作为研究对象，维生素作为生长因子，探究VB1、VB3、VB6、VB12对桦褐孔菌生物量、三萜质量分数及三萜相关代谢途径关键酶活性的影响，以提高桦褐孔菌及其活性成分的产量，为桦褐孔菌的人工栽培提供一定参考。

1 材料与方法

桦褐孔菌菌株来自东北林业大学生物农药与分子生物学实验室；高氯酸、VB1、VB3、VB6、VB12均为国产分析纯；无水乙醇(分析纯)、冰乙酸(分析纯)购自天津市富宇精细化工有限公司；香草醛(CAS号：121-33-5)购自天津市天新精细化工开发中心；维生素B1(分析纯)、白桦脂醇(标准品)(CAS号：473-98-3)购自上海源叶生物科技有限公司；法尼基焦磷酸合酶试剂盒、角鲨烯合成酶试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

KQ-300DA型数控超声波清洗器，昆山市仪器有限公司；MLS-3751L-PC高压蒸汽灭菌锅，Panasonic(日本)；Eppendorf移液器(德国)；电子天平，赛多利科学仪器(北京)；MJX-250B-Z型霉菌培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂(中国)；Sorvall Legend MicroCL 17R微量离心机，Thermo Scientific(美国)；JXFSTPRP-32全自动多样品液氮研磨仪，上海净信实业发展有限公司(中国)；SW-CJ-1FD(垂直)医用型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司(中国)；SIM-F124型制冰机，日本SANYO(日本)；微量分光光度计，杭州奥盛仪器有限公司；ZD-85恒温振荡器，苏州市国飞实验室仪器有限公司；电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；全波长酶标分析仪，天津泽瑞分析仪器有限公司。

1.1 菌株的活化

制备PDA培养基(200 g/L马铃薯、20 g/L葡萄糖和20 g/L琼脂)，灭菌结束后倒入培养皿，将4 ℃保存的桦褐孔菌菌种，在超净工作台中用接种钩将桦褐孔菌菌丝接种到PDA培养基中，放置于恒温培养箱中25 ℃避光培养，待长满平板后备用。制备PD培养基(200 g/L马铃薯和20 g/L葡萄糖)，冷却后添加VB1、VB3、VB6、VB12至50 mL(质量浓度为20、15、10、5 mg/L)，取提前活化的桦褐孔菌菌株3～4块于培养基中，转入28 ℃、150 r/min摇床培养10 d[18]。

生物量的测定：将摇床培养10 d的桦褐孔菌通过8层纱布过滤得到桦褐孔菌菌丝体，用去离子水润洗3次，收集菌丝体，将菌丝体置于烘箱60 ℃烘干，称其质量以计算菌丝体质量，并于4 ℃保存直至下一步分析。

1.2 三萜质量分数测定

以白桦脂醇为标准品，采用超声波辅助香草醛-冰醋酸-高氯酸法测定总三萜质量分数。

标准曲线的绘制：精密称取10.00 mg干燥恒质量的白桦脂醇标准品，加体积分数95%的乙醇溶液，稀释至刻度并摇匀，即质量浓度为0.2 g/L的标准品溶液，分别精密吸取标准溶液0、200、400、600、800、1 000 μL于具塞试管中，70 ℃水浴挥去溶剂。加入新配制得的5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL，再加入高氯酸1.0 mL摇匀，于70 ℃恒温水浴25 min，迅速冷却，加乙酸5 mL，摇匀，在550 nm处测定吸光值。白桦脂醇质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线[19]。

图1 三萜标准曲线(白桦脂醇标准品)

三萜质量分数的测定：准确称取桦褐孔菌粉末100 mg，加3 mL异丙醇，60 ℃浸提2 h，超声波提取15 min[20-21]。吸取提取后的桦褐孔菌总三萜异丙醇提取物溶液0.1 mL于具塞试管中，70 ℃水浴挥去溶剂，在550 nm下测定吸光值，以不加样品溶液作空白对照，用标准曲线回归方程计算其质量浓度，并乘以其体积，即为总三萜质量分数。

1.3 三萜代谢途径(MVA)相关酶活力测定

应用双抗体夹心法测定样本中法尼基焦磷酸合酶、角鲨烯合成酶。首先用纯化的真菌法尼基焦磷酸合酶、角鲨烯合成酶捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入法尼基焦磷酸合酶、角鲨烯合成酶，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的真菌法尼基焦磷酸合酶、角鲨烯合成酶呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线回归方程计算质量浓度，并乘以其稀释倍数，即为样品中真菌法尼基焦磷酸合酶、角鲨烯合成酶活性。

2 结果与分析

2.1 维生素B对桦褐孔菌生长及三萜化合物积累的影响

由表1可知，与对照组相比VB1质量浓度为5 mg/L时生物量与对照组无明显差异，三萜类物质产量最大(35.95 mg/g)；质量浓度为10 mg/L时桦褐孔菌生物量达到最大值(3.35 g/L)同时对三萜化合物的合成产生了促进作用；质量浓度为15和20 mg/L的VB1对桦褐孔菌不仅具有抑生作用同时也抑制了其三萜的合成，且随着质量浓度的增大抑制效果越明显。最终确定当VB1的质量浓度为5 mg/L时最适于桦褐孔菌的发酵(图2)。

图2 法尼基焦磷酸合酶和角鲨烯合酶标准曲线

表1 不同质量浓度VB1时桦褐孔菌生物量和三萜质量分数

由表2可以发现，VB3质量浓度为5、20 mg/L时桦褐孔菌生物量略高于对照组但其三萜的合成受到了抑制。在质量浓度为10和15 mg/L的VB3对桦褐孔菌的生长具有显著促进作用的同时也促进了三萜的合成，对生物量及三萜质量分数的综合考虑认为当VB3的质量浓度为15 mg/L时最适于桦褐孔菌的发酵。

表2 不同质量浓度VB3时桦褐孔菌生物量和三萜质量分数

由表3可见，与对照组相比VB6质量浓度从5 mg/L增加至15 mg/L时生物量达到最大(3.38 g/L)。质量浓度为20 mg/L时VB6对桦褐孔菌的生长具有抑制作用。质量浓度为5、10、15和20 mg/L的VB6对桦褐孔菌三萜的合成都具有一定的促进作用，其中，质量浓度5 mg/L时，对桦褐孔菌三萜的合成达到最大值(39.81 mg/g)。因此认为当VB6的质量浓度为5 mg/L时最适于桦褐孔菌的发酵。

表3 不同质量浓度VB6时桦褐孔菌生物量和三萜质量分数

由表4发现，质量浓度为5、10、15和20 mg/L的VB12对桦褐孔菌均具有促生作用，其中10 mg/L的VB12对桦褐孔菌的生物量具有最显著的促生作用(2.72 g/L)。在含有质量浓度为5、10、15和20 mg/L的VB12的发酵液中桦褐孔菌三萜质量分数分别是对照组的1.74、2.03、2.43、2.64倍，综合考虑认为质量浓度为20 mg/L的VB12对桦褐孔菌三萜合成的促进作用最为显著。

表4 不同质量浓度VB12时桦褐孔菌生物量和三萜质量分数

2.2 维生素B对桦褐孔菌三萜代谢相关酶活性的影响

从表5可以看出，VB1在质量浓度为5 mg/L时法尼基焦磷酸合酶的活性低于对照组，随着质量浓度的增大酶活性也随之提高，当质量浓度为15 mg/L时法尼基焦磷酸合酶的活性达到最大(32.95 μg/L)；VB1质量浓度为10、15、20 mg/L时其角鲨烯合酶的活性高于对照组，15 mg/L活性达到最高(70.66 μg/L)，VB1质量浓度为5 mg/L时，角鲨烯合酶的活性低于对照组。

表5 不同质量浓度VB1时桦褐孔菌三萜代谢途径关键酶活性

由表6可见，VB3在质量浓度为15 mg/L时酶活性低于对照组，VB3质量浓度为20 mg/L时法尼基焦磷酸合酶的活性最高(36.54 μg/L)；在5、10、15、20 mg/L质量浓度下的VB3中，培养10 d的桦褐孔菌角鲨烯合酶的活性均低于对照组，在5与20 mg/L的角鲨烯合酶的活性要高于10、15 mg/L的质量浓度下的角鲨烯合酶的活性，且质量浓度为10 mg/L时角鲨烯合酶的活性最低(60.78 μg/L)。

表6 不同质量浓度VB3时桦褐孔菌三萜代谢途径关键酶活性

由表7发现，当VB6质量浓度为10 mg/L时法尼基焦磷酸合酶的活性高于对照组，VB6质量浓度为5、15、20 mg/L时法尼基焦磷酸合酶活性与对照组并无明显差异；当VB6质量浓度为5 mg/L时角鲨烯合酶的活性高于对照组，且达到78.99 μg/L，之后随着VB6质量浓度的增加角鲨烯合酶的活性有所下降。

表7 不同质量浓度VB6时桦褐孔菌三萜代谢途径关键酶活性

由表8发现，试验组不同质量浓度的VB12的法尼基焦磷酸合酶的活性均低于对照组，其中质量浓度为5 mg/L时酶活性达到最低(20.32 μg/L)；而添加VB12的各处理组角鲨烯合酶的活性均要低于对照组，当质量浓度为15 mg/L时，其活性最低(56.74 μg/L)。

表8 不同质量浓度VB12时桦褐孔菌三萜代谢途径关键酶活性

3 讨论与结论

由于桦褐孔菌液体发酵培养生长缓慢、活性物质产量低，人工培养效果不理想，桦褐孔菌工厂化生产难以实现，因此需要对桦褐孔菌液体发酵培养条件进行不断优化。本研究以4种不同的维生素B作为外源因子，以生物量、菌丝内总三萜质量分数及三萜合成关键酶活性作为指标，探讨VB1、VB3、VB6、VB12对桦褐孔菌液体发酵的影响。研究发现，不同的维生素B在一定的质量浓度范围内对桦褐孔菌菌丝具有一定的促生作用，同时对桦褐孔菌内三萜化合物的积累具有一定的促进作用。其中VB1、VB3、VB6、VB12分别在质量浓度为5、15、5、20 mg/L时对桦褐孔菌的生物量及三萜化合物积累达到最佳；在对桦褐孔菌三萜合成关键酶活性的测定中我们发现，培养第10天时4种B族维生素对角鲨烯合酶、法尼基焦磷酸合酶的活性具有一定的促进作用但与对照组差异并不显著。

综上，本研究结果表明，维生素B在一定质量浓度下促进了桦褐孔菌菌丝的生长，初步验证了维生素B对桦褐孔菌三萜代谢关键酶活性具有促进作用，进而提高了三萜化合物的产率。这为人工获得稳定高产菌丝量及活性物质的桦褐孔菌提供了理论参考。维生素是食用菌生长发育过程中必不可少的作用因子，通常以辅酶或辅基的形式参与到食用菌相关代谢过程[14]。目前，维生素在桦褐孔菌三萜类物质的合成作用方式及作用机制尚不明确，仍需进一步研究，从而在分子层面提高桦褐孔菌活性物质的合成积累。