乳制品中AFT M1和AFT M2的系统适应性试验的验证

牛丽丽

（长治市综合检验检测中心，山西长治 046000）

黄曲霉毒素俗称霉菌毒素，是由不同黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物[1]，由于黄曲霉毒素具有强致癌性，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将其列为Ⅰ类致癌物。到目前为止，已经发现20多种黄曲霉毒素,主要有黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M26 种。其中，黄曲霉毒素M1（AFT M1）和黄曲霉毒素M2（AFT M2）是黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2在肝微粒体细胞色素P450作用下生成的羟基化代谢物[2]。

本文主要对新修订的标准GB 5009.24—2016[3]中液相色谱法的系统适应性试验进行了验证，确保本检验检测机构能够准确对乳制品中AFT M1和AFT M2进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灭菌乳、发酵乳、乳粉均购自长治市金威超市；AFT M1和AFT M2溶液标准物质，阿杰泰克公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，美国马自达公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪（荧光检测器），岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

样品提取按照GB 5009.24—2016中12.1进行操作；样品净化按照免疫亲和柱说明书进行操作。

1.3.2 标准溶液的制备

分别准确吸取AFT M1和AFT M2溶液标准物质各1 mL，共置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得100 ng·mL-1混合标准使用液。分别精密量取上述混合标准使用液 25 μL、50 μL、50 μL、100 μL、500 μL、100 μL、200 μL 和 500 μL，各置于 250 mL、250 mL、100 mL、100 mL、100 mL、10 mL、10 mL 和10 mL容量瓶中，用初始流动相稀释至刻度，摇匀。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18柱；流动相：A相为水，B相为乙腈-甲醇（50+50）；等梯度洗脱条件：A 70%，B 30%；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；波长：激发波长360 nm，发射波长430 nm；进样量：50 μL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的线性和工作范围

按1.3.2中的操作进行测定，以AFT M1和 AFT M2的浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线。在0～5 ng·mL-1呈现良好的线性关系，AFT M1的线性方程为y=3 582 690x+15 840.9，r=0.999 8，AFT M2的线性方程为y=6 777 570x+32 434.1，r=0.999 9，符合 GB/T 27404—2008[4]中验证方法相关系数不应低于0.99的规定。

2.2 柱容量、柱回收率、交叉反应率验证

每个批次的免疫亲和柱在使用前均需进行质量验证，包括柱容量、柱回收率以及交叉反应率的验证。按GB 5009.24—2016规定的操作进行测定，得到同一批次3根免疫亲和柱的AFT M1含量（111.3 ng、109.2 ng、111.0 ng）和AFT M2含量（105.6 ng、104.6 ng、105.4 ng）均＞80 ng，说明该免疫亲和柱符合同时测定样品中AFT M1和AFT M2含量的使用要求。

2.3 方法检出限和定量限

按照GB 5009.24—2016对灭菌乳和乳粉的检出限和定量限进行测定。由表1可以得到，灭菌乳和乳粉的检出限信噪比均大于3，定量限的信噪比均大于10，满足试验测定要求。

表1 检出限和定量限的确认

2.4 回收率

从表2中可以看出，样品中AFT M1添加浓度 在 0.012 5 ～ 0.500 0 μg·kg-1， 平 均 回 收 率 为89%～94%，准确度良好；同时做3水平6平行实验，RSD为2.8%～7.7%，重复性良好。

表2 AFT M1回收率分析

从表3中可以看出，样品中AFT M2添加浓度 在 0.006 25 ～ 0.500 00 μg·kg-1， 平 均 回 收 率 为79%～87%，准确度良好；同时做3水平6平行实验，RSD为1.8%～7.7%，重复性良好。回收率和RSD均满足GB/T 27404—2008对验证试验的要求。

表3 AFT M2回收率分析

2.5 不同样品中AFT M1和AFT M2的测定

分别对灭菌乳、发酵乳、乳粉各3种进行测定，所有样品中的AFT M1和AFT M2均未检出（含量均低于方法检出限）。从侧面说明了乳制品市场的稳定性，同时为广大消费者提供了参考。

3 结论

不同动物以牛奶中的AFT M1含量最高[5]，同时各种乳制品又是深受广大消费者喜爱的一类食品，考虑到黄曲霉毒素的强致癌性，GB 2761—2017[6]规定了乳制品中AFT M1的限量为0.5 μg·kg-1。食品新项目扩项工作要求满足检测标准GB/T 27404—2008项下的要求，本文通过对新修订的标准GB 5009.24—2016中液相色谱法的系统适应性试验方法进行了验证，在本检验机构检验条件下，测得该方法具有良好的准确度、精密度和重复性。在0～5 ng·mL-1AFT M1和AFT M2均呈现良好的线性关系。柱验证试验证明该免疫亲和柱符合同时测定样品中AFT M1和AFT M2含量的使用要求。方法检出限、定量限、回收率的研究也表明实验室满足定量检测AFT M1和AFT M2含量的要求。通过对9个乳制品进行测定发现，样品均未受到AFT M1和AFT M2的污染。