基于双链特异性核酸酶水解信号放大检测miRNA的方法学进展*

秦荟钧，王树急 综述，段晓雷，2△ 审校

1.遵义医科大学附属医院医学检验科，贵州遵义 563000；2.遵义医科大学检验医学院，贵州遵义 563000

微小RNA(miRNA)是一类长度约21～23 nt的短链非编码RNA分子，其通过与靶向mRNA结合在基因沉默和翻译表达中发挥作用，在基因表达调控中以及广泛的生理、病理过程中具有重要的功能[1]。有研究表明，miRNA与肿瘤发生、发展密切相关[2]。因此，在肿瘤等疾病的早期筛查中检测特异性miRNA具有重要的临床意义。但是由于在发病早期或预后阶段血液中某种miRNA水平极低[3]，因此临床诊断miRNA需要高度灵敏的检测方法。目前miRNA常见的检测方法主要包括探针杂交与扩增技术，前者包括Northern印迹技术、微阵列芯片技术等[4]，后者有实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、测序技术等[5]。但是由于实验中放射性元素的使用，临床样品对聚合酶的抑制作用，以及所需的设备和试剂成本高等相关问题，导致传统的miRNA检测方法在灵敏度和特异度方面存在一定局限；而目前芯片技术虽能实现快速、高通量的检测，但其缺点是重复性和准确性较差[6]，所以研发出高灵敏、高特异检测miRNA的新方法尤为重要。

近几年来，核酸等温扩增技术发展迅速，主要包括滚环扩增技术(RCA)[7]、环介导等温扩增技术(LAMP)[8]、催化发夹自组装(CHA)[9]等，可以有效对靶标核酸分子进行信号放大；其中，基于双链特异性核酸酶(DSN)水解反应的信号放大策略是一类比较特殊的等温扩增技术，其具有仅水解DNA-RNA杂交链中DNA的特点[10]。DSN是一种降解双链核酸中DNA链的蛋白酶，其作为非特异性DNA/RNA内切酶家族中的一员，其表现出独特的底物选择性[11]，DSN仅水解dsDNA或DNA-RNA杂交链中DNA，对单链DNA或RNA不裂解，且与核苷酸序列无关[10]，非常适宜检测RNA类靶标分子。近年来，DSN水解反应被作为一种新的信号放大策略正在被逐渐广泛用于miRNA的高灵敏度检测中，基于DSN水解反应特性对靶标分子miRNA实现循环再利用，促使微量的miRNA触发大量“信号分子”的释放，从而显著提高了检测方法的灵敏度[12]。本文着重分析与归纳了DSN介导的比色传感器、荧光传感器、电化学与电化学发光传感器检测miRNA的方法学研究进展，帮助医学检验工作者认识此类新兴技术在本领域的最新发展。同时还讨论了基于DSN水解放大效应检测miRNA新方法研究所面临的挑战及在医学检验应用中的巨大前景。

1 DSN介导的比色传感器检测miRNA

比色测定法为miRNA的检测提供了快速便捷的选择，其无需任何先进的仪器，甚至可以用肉眼观察结果[13]。在2012年，TIAN等[14]最早成功设计出基于DSN的miRNA灵敏且便捷的比色检测新方法。该方法主要是通过DSN水解DNA探针-miRNA杂交链中DNA部分，使miRNA循环利用，而DNA剩余部分形成G-四链体(单链富含G序列)与血红素结合具有过氧化物酶活性，从而使2,2-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS2-)氧化，与H2O2反应引起底物颜色变化[15]。该传感器的优点是无需昂贵的设备即可实现靶标分子的裸眼检测，并且在该系统中，无需标记探针就可以有效放大检测信号。基于其检测优点，该方法可被开发成商业试剂盒，并用于实际样品分析。因此，其检测潜力非常可观。

为了进一步构建灵敏度高与方便快捷的新型miRNA比色检测技术，王奎宇等[16]将DSN与CHA等温扩增技术相结合研发出一种双重放大信号的方法。该实验以试纸条作为信号输出方式用于miRNA的检测，DSN循环反应酶切释放CHA的启动序列并引发CHA反应，最终的产物可以在试纸条检测线上出现红线。该实验的最低检测限可达7.66 pmol/L，且能够区分单碱基序列；这种体系以试纸条作为稳定、低廉的信号输出方式，且无需昂贵的染料标记物，在今后miRNA的临床诊断领域中提供了全新的检测手段。

最近，CHOI等[17]开发了一种短时间(30 min)内快速检测靶标miRNA的比色方法，这种检测miRNA的高效诊断工具是基于nPfu DNA聚合酶[18]进行引物延伸来进行比色测定。该方法采用Cu2+螯合pp探针(焦磷酸盐传感探针)来识别引物延伸过程中产生焦磷酸盐，然后Cu2+和焦磷酸盐形成的复合物会从探针中去除Cu2+，从而导致颜色的变化[19]。这种巧妙的发夹结构介导的诊断方法可以通过焦磷酸盐的传感实现非常简单和快速的miRNA比色检测；该传感器的优点在于整个检测过程仅需要30 min，并且其在人血清中的miRNA检测限较低，可进一步发展为床旁即时检测(POCT)。上述这些比色传感新方法都清晰的表明，DSN介导的比色传感器检测miRNA新方法正在逐步满足诊断的重要要求：快速、高灵敏度、即时检测，在临床应用中显示出广阔前景。

2 DSN介导的荧光传感器检测miRNA

由于荧光传感器具有灵活简便、检测限低和易于操作等特点，因此在各种靶标分子的检测方法学研究中应用广泛。然而，靶标miRNA通常处于低丰度状态，常规的荧光检测无法定量检测出低浓度的miRNA(特别是在临床标本中)，限制了荧光技术在低浓度miRNA检测领域的发展。近年来，基于DSN水解反应的miRNA信号放大策略很好地解决了上述困境，DSN水解miRNA-DNA杂交双链中的DNA部分，miRNA解离后可循环利用，将微量miRNA信号转变为大量的DNA信号，再结合荧光技术的优势，可以很好地改善低浓度miRNA检测效果。为了设计出一种新型恒温信号放大方法用于miRNA的高灵敏度检测，李晓利等[20]将氧化石墨烯(GO)与DSN水解放大效应相结合。由于DSN可以水解双链中的DNA而不降解miRNA，GO对酶切产生的DNA碎片吸附能力显著降低，使得荧光基团远离GO表面而不被淬灭，通过DSN的不断酶切作用，荧光信号可以得到显著放大。该方法的优点是直接方便、灵敏度高，而且全程在恒温下进行，因此技术上易于实施。

除了结合使用常规的纳米材料作为检测miRNA外，PENG等[21]还设计了一种通过DSN辅助裂解荧光信号，再利用流式细胞术(FCM)灵敏、特异性地检测出多种miRNA。带有荧光纳米球(FS)的单链DNA(ssDNA)固定在二氧化硅(SiO2)微球表面上，形成SiO2-ssDNA-FS探针；当靶标miRNA与SiO2-ssDNA-FS探针杂交后，DSN选择性地水解ssDNA，并通过多个循环释放FS，使得SiO2-ssDNA-FS的荧光信号明显衰减，从而显著提高靶标miRNA的检测灵敏度。它还实现了对临床血液标本miRNA的简单、准确和定量检测。该研究新方法的优点正是基于DSN辅助miRNA循环再利用，并借助临床检验中常用的FCM技术用于miRNA检测，并且该方法允许在体外临床血液样品中miRNA的多重检测。该方法作为一种新颖的一步式淬灭荧光信号传感器，具有较高的精确度和灵敏度，可成功检测临床样品，未来该方法在肿瘤相关miRNA等的早期临床诊断中具有巨大的潜力。

miRNA家族成员通常是高度同源的序列，甚至只有一个碱基的差异[22]，由于DSN只具有核酸双链体特异性而非序列特异性，因此进一步研发基于DSN的高特异性miRNA检测新方法至关重要。XIAO等[23]设计了一种新型的纳米探针——MoS2纳米材料的分子信标(MBs)用于DSN介导的miRNA高灵敏度和特异度检测。MoS2纳米材料不仅表现出对MBs的高亲和力，而且还充当了MBs的有效淬灭剂[24]；MoS2与DSN结合的强淬灭荧光能力有助于该方法获得更高的灵敏度，其检测限(LOD)比传统检测方法低4个数量级；由于MBs和DSN的单碱基区分能力，还显示出较高的选择性，可用于区分具有单一碱基差异的同类miRNA序列；此外，装载MoS2的MBs纳米探针还可用于miRNA的多重检测。鉴于其高灵敏度和多重检测功能，这种新型传感器在生物医学研究和临床诊断中具有广阔的应用前景。

除了上述常规的基于DSN的荧光传感器检测miRNA外，还有新开发的基于磁性纳米材料及以量子点为信号分子的荧光生物传感器。目前在已经报道出多种基于DSN的miRNA检测生物传感器，其常常采用多种有机染料作为“信号分子”，并且他们大多数都结合一些功能强大的纳米材料例如金纳米(AuNPs)、氧化石墨烯(GO)、MoS2纳米片等来淬灭荧光团的荧光，以设计新颖的基于DSN的miRNA生物传感器[25-26]。由于这些检测方法具有可量化、高灵敏度和特异度等优点，因此检测miRNA效果更佳。研究表明，磁性纳米珠(MNs)由于其优异的磁选性能，在磁芯组装方面具有广阔的应用前景[27-28]，并且量子点在同时检测多种病毒核酸序列或病毒粒子方面具有独特的优势[29]。最近，WANG等[30]设计了一种利用磁性纳米珠和量子点组装的“卫星结构”用于检测多种肠道病毒71型(EV71)相关的miRNA，通过记录悬浮液中量子点的荧光信号，还可以轻松实现定量检测。该磁性纳米材料及量子点形成的“卫星结构”，结合DSN水解反应实现靶标miRNA循环，既降低了样品污染和降解的风险，又可以同时检测多种miRNA。目前，该方法已成功用于监测EV71感染细胞在不同时间点的miRNA表达水平，充分展示了其诊断与治疗应用的潜力。

3 DSN介导的电化学传感器检测miRNA

电化学传感器与荧光、比色传感器相比，具有检测灵敏度高、专一性强、操作简便且能在复杂体系的临床标本中实现miRNA检测等优势[31]；电化学发光法则进一步在电极表面发生电化学反应与化学发光持续循环进行，实现超高灵敏度分析与显著光学信号检测[32]。近年来，利用DSN水解效应放大miRNA信号并基于电化学与电化学发光平台，研发出许多独居匠心的新型生物传感器。2019年，ZHUANG等[33]研发出一种偶联捕获探针(CPs)的AuNP修饰金电极(AuNP-AuE)的电化学生物传感器，用于胃癌血清中miR-100的快速、灵敏和特异性检测。当靶标miR-100与CPs在电极表面杂交，加入DSN水解杂交链中的CPs部分使电极的暴露产生电化学信号；该电化学传感器对miR-100的检测范围为100 aM～10 pM，检测限(LOD)大约为10 aM，且可直接用于临床胃癌血清中的miRNA检测，因此该方法在恶性肿瘤的早期临床诊断中有着巨大发展潜力。

为了突破生物识别组件的保质期有限与非特异性吸附等电化学检测中的技术“瓶颈”，WANG等[34]在电极表面共修饰金纳米和银纳米颗粒(AgNPs)中成功的开发了一种高度特异性检测靶标miRNA的电化学生物传感器。在存在靶标miRNA的情况下，AuNPs上的DNA与miRNA杂交，加入DSN将水解杂交链中的DNA，裸露AuNPs允许AgNPs结合产生电化学信号；而干扰性miRNA存在时则DSN反应不发生，AuNPs上的DNA阻碍AgNPs结合而无电化学信号。该方法最大优点在于有效区分检测靶标miRNA和干扰性miRNA，LOD低至0.62 fM，未来该传感器可能用于miRNA相关生物医学研究和疾病诊断的miRNA生物标志物筛选。

近年来，新型纳米材料被逐渐应用于miRNA的高灵敏、高特异的电化学发光检测研究中。2017年，南京大学的HUO等[35]利用静电斥力和体积排斥作用研发出一种基于AuNPs修饰的DNA探针(DNA-AuNPs)与鲁米诺阴离子探针、阳极氧化铝(AAO)纳米孔电极协同作用的miRNA电化学发光传感器。当靶标miR-107存在并与AuNPs修饰的DNA探针杂交时，加入DSN可水解其中DNA部分，AAO反应膜上的鲁米诺电化学发光信号增强；相反，没有靶标miRNA时AAO反应膜上的Ru(bpy)32+电化学发光信号增强。该双阳性信号体系可高灵敏、高特异地检测miRNA，并调整捕获DNA探针序列就可扩展到其他miRNA的检测应用中。

ZHU等[36]首次提出了一种基于DSN酶切循环和量子点修饰西瓜种子状介孔纳米球的双信号放大电化学发光(ECL)生物传感器。通过嵌入CdTe量子点成功制备了纳米微晶纳米粒子(mSQSNSs)进入到二氧化硅的介孔材料从而极大增加了电化学发光的信号：当靶标miRNA存在时，AuNPs修饰的磁珠(Fe3O4@Au)表面的发卡型DNA探针被打开，加入DSN水解DNA-miRNA杂交链中的 DNA 部分产生连接短链DNA的Fe3O4@Au，并进一步与mSQSNSs耦联形成电化学发光的二次信号放大，巨大的纳米复合物富集在电化学发光电极表面产生信号。该电化学发光法检测miRNA达到33 fM，并实现临床血液标本检测，为肿瘤早期筛查提供了潜在的技术工具。

4 总结与展望

综上所述，基于DSN水解反应信号放大策略在特异性检测体内微量浓度miRNA方面具有独特的优势，其只水解与miRNA互补的DNA序列，靶标miRNA得以循环再利用；这使得基于DSN的miRNA检测分析新方法因其优越的传感性能而备受关注[37-38]。基于DSN新方法的灵敏度和特异度与miRNA分析金标准(qRT-PCR方法)相似，但比qRT-PCR方法更快、更方便、更便宜；其结合比色、荧光、电化学、电化学发光等分析平台，近年来已经发展出多种类型的miRNA检测新策略和新方法。基于DSN的信号放大策略是目前提高miRNA检测灵敏度和特异度的最有效方法之一，在特定miRNA的早期诊断中显示出良好的潜力。

当然，尽管基于DSN信号放大策略检测miRNA的方法学领域已经取得了许多重要进展，但是要真正实现临床实际样品中miRNA的高选择性和高灵敏度的普适性检测方法仍面临许多挑战。其中，与靶标miRNA结合DNA探针的设计应是目前基于DSN水解反应放大策略检测miRNA时最大的问题，这主要是由于传统ssDNA探针与DSN反应前后都会存在ssDNA的非特异性后续反应的假阳性信号；近年来人们逐渐引入发卡结构探针[17]、双发卡探针[39]、G4 DNA探针[40]等抵消非特异单链DNA导致的假阳性。另一方面，DSN的酶活性本身有一定的局限性：DSN需要至少10 bp的杂交底物才能有效切割[41]，DSN只切割双链DNA(不具有序列特异性)使得多重检测难以实现[11]；因此，需要额外的材料、新策略来辅助提升检测低丰度miRNA的分析灵敏度，正如本文归纳描述中的纳米技术和新型材料(金纳米颗粒、石墨烯、磁珠、量子点等)被大量引入基于DSN放大策略检测MiRNA的新方法中[42-43]，用来增加探针的数量或检测信号的强度。这些问题的逐渐解决正是未来更多新颖的DSN信号放大策略检测miRNA的方法学研究的前进方向，科研人员不断开发出更加灵敏、稳定、高通量的 miRNA 生物传感器，将在肿瘤等疾病相关miRNA的临床标本早期检测领域中取得更加丰硕的成果。