高尿酸通过下调UCP2表达水平引起线粒体损伤的研究*

赵建越，孙 宇，顾李霖，王会中

中国人民解放军第三〇五医院检验科,北京 100017

高尿酸血症是临床上一种常见的疾病，高尿酸一旦形成晶体并沉积就会诱发局部炎症反应和组织破坏，即形成痛风。高尿酸血症的形成原因比较复杂，且患病率呈逐年增加并出现年轻化的趋势[1-2]。目前有研究表明，高尿酸血症和痛风是慢性肾病、高血压、心脑血管疾病及糖尿病等疾病的独立危险因素，是引起死亡的独立预测因子[3-4]，因此高尿酸血症逐渐引起相关学科的高度重视。尿酸是一种关键性的促炎因子，随着尿酸浓度的增高其能够抑制细胞增殖、衰老甚至凋亡，尿酸还能够对线粒体DNA和三磷酸腺苷(ATP)合成造成影响[5-7]。线粒体是细胞中的重要细胞器之一，是细胞内最重要的生物能量转化装置，在线粒体内依靠电子传递和质子漏来控制ATP的产生。线粒体解偶联蛋白2(UCP2)作为解偶联蛋白家族中重要成员是线粒体内重要的跨膜蛋白，且与质子调控高度关联，是线粒体内电化学梯度的重要调节蛋白，研究表明UCP2能调节线粒体损伤指标活性氧(ROS)的生成，调控ATP的合成和线粒体膜电位差等来调节机体的氧化应激能力[8-9]。尿酸特别是高尿酸作为一种促氧剂能够对细胞以及线粒体造成损伤[10]，但目前高尿酸对线粒体UCP2及其相关指标的影响研究较少，尿酸对线粒体损伤的生理功能还尚未清晰，尿酸对线粒体内环境以及线粒体内能量转化等的影响问题还尚待解决，因此还有许多基础工作要做。本文则在细胞水平上分析了高尿酸对细胞线粒体损伤，分析了UCP2表达水平变化及尿酸对UCP2相关指标ROS、线粒体膜电位、ATP合成的影响，初步探讨高尿酸对细胞线粒体损伤的可能机制，为深入研究尿酸对线粒体损伤原理提供相关支持，并通过这些分析为高尿酸血症的临床控制和治疗提供可能的作用靶点。

1 材料与方法

1.1材料 实验采用HL7702细胞，为健康者肝源细胞，购自上海富衡生物有限公司。

1.2仪器与试剂 噻唑蓝(MTT)、尿酸试剂由sigma公司生产并根据使用说明书进行所需浓度配制；细胞培养基RPMI1640由HyClone (SH30809.01)公司生产；胎牛血清由美国GIBCO(10270-106)公司生产；总RNA提取试剂盒购自上海羽朵生物科技有限公司(00266)；所需引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成； FastKing cDNA第一链合成试剂盒从天根生化科技(北京)有限公司购买(KR118-02)；Real-time PCR试剂盒从北京全式金生物有限公司购买(AQ131-01)；Western blot蛋白裂解液从上海碧云天生物技术有限公司购买(P0013)；UCP2一抗从Proteintech Group公司购买(11081-1-AP)；GAPDH一抗(BM1623)、二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(A0208)，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216))从上海碧云天生物技术有限公司购买；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)从索莱宝科技有限公司购买(中国，M8650)；ROS检测荧光探针-DHE(二氢乙锭)从江苏凯基生物技术有限公司购买(KGAF019)；ATP水平检测试剂盒从北京索莱宝科技有限公司购买(BC0305)，所有试剂均在效期内。 ABI7500实时荧光定量PCR(Q-PCR)仪(ThermoFisher,美国)；酶标仪(Thermo，型号：MULTISKAN FC，美国)；生物荧光倒置显微镜(OLYMPUS(IX71)，德国)；所有仪器均经过校准。

1.3方法

1.3.1细胞培养 HL7702细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI1640培养基培养，在恒温培养箱中以5% CO2、37 ℃以及饱和湿度条件下松盖培养，每1～2 d换液1次，当细胞长至铺满80%培养瓶时再消化传代。

1.3.2MTT实验筛选尿酸作用时间 实验分为3组，分别培养24、48、72 h，每组依据参考文献加入终浓度分别为400、800、1 200 μmol/L的尿酸作用细胞，对照组加等量的生理盐水，对不同时间分组细胞加入100 μL 10% MTT反应液，酶标仪测定在595 nm处的吸光度，分析细胞活性确定培养时间。

1.3.3Q-PCR法比较UCP2的mRNA表达水平 采用TRIZOL法提取细胞总RNA，用FastKing cDNA第一链合成试剂盒，反转录为cDNA，采用20 μL Q-PCR反应体系[引物各0.4 μL，2×supermix(预混液)10 μL，PASSIVE DYE(参比染料) 0.4 μL,模板 2 μL，水 6.8 μL]，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，比较HL7702细胞UCP2的mRNA表达差异，引物见表1。内参及UCP2引物大小均为20 bp。

表1 UCP2和内参GAPDH的引物序列(5′-3′)

1.3.4Western blot检测HL7702细胞UCP2水平 离心收集细胞，每份样品加150 μL裂解液，于冰上裂解45 min，并轻摇细胞促进细胞充分裂解，4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，并测定蛋白质浓度。分别取100 μg不同尿酸浓度处理的细胞总蛋白，用SDS-PAGE电泳分离，然后转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，于5%脱脂奶粉的封闭液(TBST)封闭2 h，再用UCP2和GAPDH一抗4 ℃过夜，洗去多余一抗，二抗37 ℃ 2 h，洗去多余二抗，电化学发光(ECL)法显色分析结果。

1.3.5免疫荧光法检测ROS生成 以二甲基亚砜(DMSO)溶解DHE为 5 mmol/L 的溶液，去除细胞培养液，每孔加入1 mL稀释好的DHE，37 ℃细胞培养箱内孵育20～30 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DHE，孵育结束后，用新鲜培养液清洗细胞，荧光显微镜进行荧光拍照，通过荧光强度对ROS生成量进行评估。

1.3.6JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位 按要求配置好染色工作液，细胞中加入 1 mL JC-1 染色工作液，充分混匀，细胞培养箱中37 ℃孵育20 min，孵育结束后，吸除上清，用 JC-1 染色缓冲液(1×)洗涤2次，加入2 mL细胞培养液，荧光显微镜下观察。

1.3.7ATP水平检测 按试剂盒要求进行ATP的提取，酶标仪在波长为340 nm测定吸光度，根据试剂盒参考共识进行ATP水平的数据测算。

2 结 果

2.1MTT法筛选尿酸作用细胞时间 从图1可见细胞培养72 h后不同浓度尿酸的MTT吸光度值比较，差异有统计学意义(P<0.05)，因此选取72 h作为后续实验时间。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。图1 MTT实验筛选结果图

2.2细胞UCP2的mRNA转录水平以及UCP2蛋白表达水平数据分析 不同浓度尿酸处理后UCP2 mRNA转录表达水平差异有统计学意义(图2)，3个浓度组(400、800、1 200 μmol/L)细胞的UCP2mRNA转录水平与对照组相比均呈现出明显下降趋势，分别占对照组的46.30%、16.40%和5.00%。同时，UCP2蛋白表达分析发现(图3)，UCP2的蛋白表达与对照组相比均呈现出明显下降趋势，且随着尿酸浓度的增加呈逐渐递减趋势。

注：**表示P<0.01。图2 不同浓度尿酸处理的细胞培养72 h后，线粒体UCP2的mRNA转录水平

图3 不同浓度尿酸处理的细胞培养72 h后，线粒体UCP2的蛋白表达结果

2.3细胞线粒体ROS生成量的分析 与对照组相比,3个浓度组(400、800、1 200 μmol/L)的ROS荧光强度分别为对照组的133倍、184倍和253倍(图4、图5)，细胞线粒体中ROS的生成量呈逐渐升高状态。

注：荧光越强说明ROS生成量越大，**表示P<0.01。图4 不同浓度尿酸处理的细胞培养72 h后，细胞ROS荧光强度量化分析图

注：随着尿酸浓度增加荧光强度越强，ROS生成量越多。图5 不同浓度尿酸处理的细胞培养72 h后，细胞ROS荧光显示图

2.4细胞线粒体膜电位的变化分析 与对照组相比，3个浓度组(400、800、1 200 μmol/L)线粒体膜电位分别为对照组的14.53%、8.30%和4.70% (图6、图7)，细胞线粒体中线粒体膜电位呈逐渐降低趋势，说明高尿酸对线粒体UCP2抑制作用会造成线粒体膜电位的降低，即降低线粒体基质与内膜间的电位差。

注：**表示P<0.01。图6 不同浓度尿酸处理的细胞培养72 h后，尿酸对细胞线粒体膜电位的影响变化图

注：随着尿酸浓度增加绿色荧光强度越强,线粒体膜电位越低。图7不同浓度尿酸处理的细胞培养72 h后，细胞绿色荧光示意图

2.5ATP水平检测分析 与对照组相比，3个浓度组(400、800、1 200 μmol/L)ATP合成率为对照组的83.45%、69.92%和55.64%，随着尿酸的浓度增加而ATP水平逐渐减少。见图8。

注：**表示P<0.01。图8不同浓度尿酸处理的细胞培养72 h后，ATP水平变化图

3 讨 论

近年来高尿酸血症发病率逐年升高，尿酸的高低与否已经成为备受重视的一项指标，而随着尿酸浓度的逐渐升高细胞内特别是线粒体内则发生着氧化应激和慢性炎症等一系列的反应[6]。氧化应激是细胞氧化系统和抗氧化系统之间的不平衡，是氧化自由基和ROS过度产生的结果[10-11]。而高尿酸作为一种促氧化剂在多个细胞和动物模型中被证实能够引起局部炎症和氧化应激，能够造成ROS的增加并抑制细胞增殖和影响细胞形态甚至是促进细胞走向凋亡[10,12]。线粒体内膜蛋白UCP2是UCP家族中的重要一员，它与电子传递中的质子泄露相关联，能够通过调控质子泄露来影响细胞氧化应激反应，并影响电子传递链的过程中的ROS的生成、线粒体膜电位的变化和ATP的合成[8,13-14]。而在目前的研究中发现，UCP2蛋白表达水平与多种疾病相关如肥胖、糖尿病、心脏疾病和高血压等，并在这些疾病中起到调节氧化应激压力的作用[15-18]。有研究发现UCP2能够降低ROS的产生起到保护细胞的作用[11,17-18]，如一些关于慢性高糖的相关研究中就证实UCP2是能够降低ROS的产生，这可能是由于葡萄糖为细胞所必需的营养物质，葡萄糖会促进细胞增殖从而导致UCP2过表达。但这些研究都是以糖类和脂类代谢为基础进行研究，并未将尿酸作为一个独立因素进行研究。特别是在近年来高尿酸血症越来越年轻化的趋势下，将尿酸特别是高尿酸作为一个影响身体健康的指标来研究具有一定的指导意义，因此研究尿酸对体内细胞的损伤机制将成为一个重要课题。

线粒体UCP2是细胞内与能量代谢相关的重要蛋白，是控制线粒体膜间隙与基质之间电势的关键性蛋白，因此研究尿酸对UCP2的影响将关系着整个细胞的能量代谢和生命活动。本研究发现经过不同浓度尿酸处理72 h后，细胞中线粒体UCP2蛋白表达呈明显降低趋势；线粒体UCP2的mRNA转录水平分别为对照组的46.30%、16.40%和5.00%，这说明尿浓度越高对线粒体UCP2的表达抑制越强。而且本研究发现经过不同浓度尿酸处理72 h后线粒体膜电位分别为对照组的14.53%、8.30%和4.70%；ATP合成率分别为对照组的83.45%、69.92%和55.64%。由于线粒体UCP2表达减少则会造成线粒体膜间隙与基质之间质子梯度变小，结果会降低线粒体内膜内外的电势，而膜电位的降低则会造成ATP合成的减少，而且从结果中不难发现尿酸浓度越高则对线粒体UCP2的影响就越大，对线粒体UCP2影响越大则线粒体膜电位和ATP合成率就越低,可见尿酸的浓度与线粒体UCP2表达、膜电位和ATP合成呈负相关，且上述结果说明尿酸特别是浓度越高的尿酸对线粒体UCP2的影响越大，对线粒体的损伤就越大。在另一项线粒体UCP2的相关评估指标ROS中，则是随着尿酸浓度增加，3个浓度尿酸处理细胞的ROS荧光强度分别为对照组的133、184和253倍，呈逐渐升高的趋势，这说明随着尿酸浓度的逐渐升高，尿酸抑制了UCP2的生成进而导致细胞产生大量的ROS，而不是起到促进UCP2过表达降低ROS的作用，这与高糖高脂等可能促进UCP2过表达而降低ROS的研究产生了不一致的结果，而且随着尿酸浓度的升高ROS生成就越多，对线粒体损伤性就越大，这说明高尿酸对细胞的损伤可能是一种不可逆性的损伤。从上面的实验结果以及结合其他研究成果，可以得到以下结论：高尿酸对线粒体UCP2的表达可能存在着抑制作用，高尿酸对细胞的损伤作用可能的机制之一就是高尿酸对线粒体UCP2的损伤，进而造成膜电位的降低、ATP合成的减少以及ROS的大量产生并最终引起线粒体和细胞的损伤。如果能够切断或者减少高尿酸对UCP2的表达抑制就可能会对高尿酸血症的治疗起到更好的协同作用。但本实验主要是在细胞水平上进行初步的分析，还缺少动物实验方面的数据来支持，在下一步的实验中将更加细致的分析高尿酸在动物体内对线粒体UCP2的影响，分析高尿酸对线粒体以及线粒体内微生态的损伤机制。

综上所述，本文着重研究了尿酸在不同浓度情况下对线粒体UCP2蛋白表达的影响，初步阐述了高尿酸对线粒体UCP2相关联的ROS的生成、线粒体膜电位的变化和ATP的合成在不同浓度下的影响程度，初步验证了高尿酸对细胞损伤的可能的机制之一即对细胞线粒体UCP2蛋白表达的抑制作用，并为进一步研究高尿酸对细胞中线粒体损伤机制提供了理论支持。本研究还发现随着尿酸浓度的增高，尿酸对细胞的危害就越大，这就提示人体内也可能存在着类似情况，而且长时间的高尿酸不被重视后还可能和高血压、高血糖、高血脂、心肌炎、动脉粥样硬化等相关疾病相互作用。因此，高尿酸必须要引起重视，特别是一些年轻患者，早发现、早控制、早治疗是应对高尿酸的最正确的选择。