番茄早疫病菌dsRNA多样性分析

刘升学,李思琪,王晓东,杨德松

(1.石河子大学分析测试中心,新疆石河子 832000;2.石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室,新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】番茄早疫病(Alatenariasolani)在新疆各番茄种植区均有发生,常年发病率在50%以上,可危害番茄植株的叶片和茎,造成番茄早衰,影响番茄产量,感染果实后造成果实霉烂[1]。番茄早疫病是由链格孢(Alternariasolani)侵染引起的一种气传病害,在新疆番茄种植区普遍发生。有效控制早疫病是确保新疆加工番茄丰产、丰收的重要措施之一。利用携带病毒的弱毒株引起病原菌群体致病力衰退,将成为真菌病害生物防治的新途径[2-3]。【前人研究进展】从植物病原真菌到大型食用真菌 (不包括真菌介体传播的非真菌病毒) 普遍存在病毒[4-6],其中一些真菌病毒侵染后能够减弱植物病原真菌的致病性,从而可用于植物病害的防治。Dodds等[7]证明在板栗疫病菌(Cryphonectria.parasitica)弱毒株中分离到的dsRNA粒体与其寄主出现致病力减弱现象有关,之后成功利用板栗疫病弱毒病毒Cryphonectriahypovirus1(CHV1) 控制了栗树疫病, 成为了利用致病力衰退相关的真菌病毒生防植物真菌病害最为经典的实例[8-10]。 Yu 等[11]在核盘菌菌株 DT - 8 中发现了真菌 DNA 病毒SclerotiniasclerotiorumhypovirulenceassociatedDNAvirus1(SsHADV1),发现其可以引起核盘菌致病力减弱;Wu 等[12]在灰霉菌中发现了使寄主致病力减弱的 dsRNA病毒BotrytisporriRNAvirus1 (BpRV 1);Li 等[13]在镰刀菌中发现了具有弱毒特性的 RNA 病毒FusariumgraminearumHypovirus2(FgHV2);曹钰晗等[14]通过对苹果斑点落叶病菌的链格孢苹果专化型(A.alternataf.sp.mali)dsRNA分析,携带 dsRNA 的菌株多为弱致病力菌株,致病力最低的 QY-2 菌株携带Alternariaalternatachrysovirus2(AaCV2),可能具有潜在的应用价值,可为苹果斑点落叶病提供新的生防资源。链格孢属(Alternariassp)也存在真菌病毒。Shepherd从棉花种子分离到的21株Alternariaalternata菌株中,有6株含1.0～5.1 kbp的3条dsRNA,其中两个分离物的dsRNA与30 nm大小的病毒粒体相关联[15]。Zabalgogeazcoa等[16]从A.solani分离得到包裹在80～100 nm的球状膜囊泡中、没有壳体化、大小为8.3和5.5 kbp的dsRNA。Hayashi等[17]报道,12株A.alternata日本梨致病型中7株中含有1.0～8.0 kbp的dsRNA。Aoki等[18]从A.alternata分离得到EGS 35-193,含有大小为3 617、2 794、2 576和1 420 bp的四条dsRNA,观察到EGS 35-193减弱菌丝生长和菌落色素沉积,被命名为A.alternatavirus1 (AaV1)。Fuke等[19]从日本梨树的病原菌A.alternata分离到N18,含有几条dsRNA,使菌落生长表现出不规则和非正常的菌落色泽等表型特性,给予寄主菌细胞如细胞凋亡之类的负面影响。Lin 等[20]从烟草赤星病A.longipes分离得到 dsRNA 病毒AlternarilongipesdsRNA virus 1(AlRV1)。KOMATSU 等[21]从乔木链格孢(A.arborescens) 中发现一个新的维多利亚病毒Alternariaarborescensvictorivirus1(AaVV1);ZHONG等[22]从芸薹生链格孢(A.brassicicola)中发现病毒Alternariabrassicicolafusarivirus1(AbFV1);向均[23]从链格孢日本梨致病型中分离出病毒Alternariabotybirnavirus1 (ABRV1);OKADA等[24]从链格孢日本梨致病型中分离出病毒Alternariaalternatachrysovirus1(AaCV1),损害宿主真菌的生长,同时影响宿主AK毒素的产生。曹钰晗等[14]通过对A.alternataf.sp.mali 的dsRNA研究,确定含有5组分的AaCV2。【本研究切入点】目前,已报道了多种作物链格孢属真菌病毒,但关于番茄早疫病菌真菌病毒还未见报道,有待进一步解析。【拟解决的关键问题】采集新疆石河子周边加工番茄早疫病菌样品,通过提取dsRNA和序列分析,分析加工番茄早疫病病菌(A.sonali)携带病毒的情况,为研究利用真菌病毒来控制番茄早疫病害提供生防资源。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

供试菌株2015～2022年分别采自新疆石河子周边加工番茄种植区,通过组织分离法和单孢分离得到纯培养。

1.1.2 主要试剂和仪器

CF-11Wwaters公司;Tris、SDS、EDTA-Na、乙酸钠上海生工生物技术有限公司;TaqMix、感受态细胞、琼脂糖凝胶回收试剂盒,Tiangen公司;氨苄、麦康凯北京Solarbio公司;载体 pGM-T Promega公司;pMD19-T、PrimScript TMreagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒TaKaRa公司;台式冷冻高速离心机(5425R)Eppendorf公司;PCR仪、电泳仪,BIO公司;BioRad 凝胶成像系统,美国 SYNGENE 公司;超净工作台,江苏苏净集团公司。

1.2 方 法

1.2.1 dsRNA的提取

病毒dsRNA的提取方法采用纤维素CF-11吸附法。提取到的dsRNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.2 RT-PCR

1.2.2.1 引物合成

随机引物RP26:5’-GACGTCCAGATCGCGAATTCNNNNNN-3’,RP20:5’-GACGTCCAGATCGCGAATTC-3’参照文献[25],通用引物T7、SP6,均由上海生工生物技术有限公司合成,M13F、M13R北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

1.2.2.2 RT-PCR

提取到的dsRNA经65℃变性后合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增,反应体系为25 μL,95℃预变性5 min,95℃30 s,56℃30 s,72℃1 min,循环30次后,72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,回收400～1 000 bpDNA条带区域。回收产物与pGM-T /pMD19-T克隆载体于16℃连接30 min后,转化DH5α感受态细胞,37℃过夜培养。菌落PCR筛选阳性克隆,随机挑选96个序列测定,委托北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

1.3 数据处理

测序结果及数据处理等借助DNAMAN软件完成。利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库的Blast搜索比对同源序列。

2 结果与分析

2.1 dsRNA提取结果

研究表明,用纤维素(CF-11)吸附法从分离到的191早疫病菌株(2015年采36株、2016采16株、2022采139株)中提取dsRNA,经琼脂糖凝胶电泳观察,有43株中检测到1～4条dsRNA条带,其带毒率为22.5%。其中22菌株检测到1条dsRNA,占总株数的11.5%,占带毒株数的51.1%;菌株A8、A9、A13、A18、A32、AS1、AS5、AS10、T4、T64、S1、S7和S8的大小约为10 kb,G3、G4、S11、S13、H80和H81约为8 kb,H74、H86和H101约为3.7 kb。有14株菌株中检测到2条dsRNA条带,占总株数的7.3%,占带毒株数的32.6%;A24和AS24大小约为5.5和1.7 kb,A12、A33、AS4、H5、H6、H63、H114和H116约为4.0和3.5 kb,H77约为3.0和3.0 kb,A6、H4和H84约为2.5和2 kb。有5株菌株中检测到3条dsRNA条带,占总株数的2.6%,占带毒株数的11.6%;H49和H53大小约为8、4和3.5 kb,H79、H82和H83约为7.0、3.5和3.0 kb。有2株菌株中检测到4条dsRNA条带,占总株数的1.1%,占带毒株数的4.7%;A19和AS11大小约为10、4、3和1 kb。图1

注:M,DNA Maker;A、AS、T、G、H代表菌株(a样品采自2015年,b采自2016年,c、d采自2022年不同集结季节)

2.2 RT-PCR

研究表明,以AS24、G3、S8、T4、H63和H74株菌的dsRNA为模板,用RP26和RP20为引物进行RT-PCR,得到200～1 500 bp弥散DNA条带,回收400～1 000 bp的区域,纯化后克隆到pGEM-T/pDM19-T上,选取经PCR检测为阳性的96个单克隆进行序列测定。

2.3 序列测定(表1)

2.3.1 AS24菌株

AS24菌株携带两条dsRNA,经拼接得到组分1(dsRNA-L)大小为2 506 nt和组分2(dsRNA-S)1 483 nt的Contigs。dsRNA-L与整体病毒科(Totiviridae)的Helminthosporiumvictoriaevirus190S(HvV 190S)外壳蛋白和RdRp(RNA dependent RNA polymerase genes)的序列同源性为63%,与Bipolarismaydisvictorivirus(BmV1)BmV1b/CY27、BmV1c/CY27和BmV1d/CY27株系的序列同源性为62.0%;dsRNA-S与双分病毒科(Partitiviridae)的Alternariatenuissimapartitivirus1(AtPV1) RNA2、PlasmoparaviticolalesionassociatedPartitivirus10(PVLaPV10) 的DMG-B_DN51686分离物、Erysiphenecatorassociatedpartitivirus8(ENaPV8)的PMS-DN6389分离物外壳蛋白序列序列同源性分别为54%、53%和51%;AS24菌株携带的两条dsRNA分别是Totiviridae和Partitiviridae的两种病毒。

2.3.2 G3菌株

G3得到1 189、694和889 nt的三个Contigs、Contigs1与Totiviridae的AaVV1、ConiothyriumminitansRNAvirus(CmRV)序列同源性为74%、59%;Contigs2和Contigs3与Totiviridae的Uncultured totivirus RdRp相对应区域的同源性为90%和100%;表明G3菌株携带两种Totiviridae的病毒。

2.3.3 S8菌株

S8菌株得到3 411和559 nt的三个Contigs、Contigs1与Totiviridae的AaVV1 基因组RNA和CmRV分离物CmRV-IL序列同源性为92%,与Bipolarismaydisvictorivirus2(BmVV2) 株系CY05 外壳蛋白的序列同源性分别为81%;Contigs2与Partitiviridae的Ustilaginoideavirensnonsegmentedvirus1(UvNV-1)株系 GX-10 同源性为23%;表明S8菌株携带Totiviridae和Partitiviridae两种病毒。

2.3.4 T4菌株

T4菌株得到大小分别为877、364、878和371 nt 4个Contigs。Contigs1、2和3未找到有同源性的序列,可能是未知新病毒的序列。Contigs4与芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)的Triticumpolonicummycotymovirus1 (TpMV1)复制酶HP2和 HP3的序列同源性为99%,T4菌株除了携带Tymoviridae的一种病毒,还可能携带一种未知新病毒。

2.3.5 H74菌株

H74菌株得到3 262 nt的Contigs,与未分类的 AlRV1株系HN28序列同源性99%,是不同来源的同一种病毒的不同分离物。

2.3.6 H63菌株

H63的两条dsRNA获得大小为3 684、22 532、825、1 105和1 418 nt 5个Contigs,Contigs1、2、4和5分别对应于产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)的AaCV1 RNA1-4。Contigs1与 AaCV1分离物CREA-VE-32SY2和AaCV1的RNA1序列同源性达98%,与株系QY-2为86%;Contigs2与RNA2序列同源性达83%;Contigs4与RNA3序列同源性为97%;Contigs5与RNA4 序列同源性分别为64%和99%。但Contigs3则与裸露病毒科(Narnaviridae)的Erysiphenecatorassociatednarnavirus27(ENaNV27)分离物PMS2_317序列同源性为93%。H63菌株携带分属于Chrysoviridae与Narnaviridae的两种病毒。

3 讨 论

3.1目前,对于番茄早疫病防治主要依赖化学农药,而化学农药的过度使用威胁食品安全,导致环境污染和病原菌抗药性增强。真菌病毒是能够在真菌细胞内复制和增殖的病毒,其中一些真菌病毒侵染后能够减弱植物病原真菌的致病性,从而可用于植物病害的防治。自从CHV1成功的控制了栗树疫病[8-10],以真菌病毒为核心的生防产品的研发和应用能够减少化学农药用量、延缓病原菌的抗药性。Chiba 等[26]从苹果白色根腐病的病原真菌(Rosellinianecatrix)中分离的 W799 具有研制成生防试剂的潜力。Yu X等[27]从核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)中分离的病毒 SsHADV-1,证实可以在寄主的营养体不亲和型菌株之间扩散和复制,并引起健康宿主菌株致病力衰退,预示者 SsHADV-1 具有良好的生防潜能。曹钰晗等[14]研究认为,采自我国苹果产区苹果斑点落叶病菌菌株中致病力弱的 QY-2 菌株所携带AaCV2病毒,可为防治苹果斑点落叶病提供新的生防资源。研究通过分离培养A.sonali,提取dsRNA筛选带病毒菌株,其带病毒率为22.0%,为筛选致病力弱,开发具有生防潜质的菌株提供资源。

3.2已报道的链格孢属的真菌病毒,其RNA类型有ssRNA和dsRNA两种类型,核酸组分从1条链到多条链不等,片段大小也不尽相同。从棉花种子中分离出6个携带真菌病毒的链格孢菌株,dsRNA片段在1.0～5.1 kb[15];从茄链格孢中检测到两条dsRNA大小分别为 8.3和5.5 kb[16];另外还有真菌病毒AaV1(dsRNA片段:3 617、2 794、2 576、1 420 bp)[18]、AlRV1(dsRNA 片段:3145 bp)[20]、AaVV1(dsRNA片段:5 203 bp)[21]、AbFV1(ssRNA片段:6 639 bp)[22]、ABRV1(dsRNA片段:6 188、5 903 bp)[23]、AaCV1(dsRNA片段:3 647、2 857、2 785、2 772、836 bp)[24],AaCV2(两条dsRNA条带对应于3 665、3 054、2 824、2 819、8 31 bp)[14],两条dsRNA不同链格孢菌株携带 dsRNA 存在差异。研究从42菌株中提取的dsRNA,检测到1条、或2条、或3条、或4条dsRNA条带,在分子量大小上也存在差异。番茄早疫病中dsRNA具有一定的普遍性,根据条带数量和分子量大小来看,病毒种类具有多样性。但对应于dsRNA条带的病毒种类,有可能是单一的一种病毒,也有可能是基因组大小相近的多种病毒复合侵染所形成,还有可能是一种病毒的不同组分。从苹果斑点落叶病菌分离得到QY-2菌株的dsRNA通过琼脂糖凝胶电泳时观察到大小两条dsRNA带[17],经序列分是一种病毒的5个RNA组分,dsRNA1-4在电泳时形成混合的一条带,dsRNA5是一条分子量小的带,因此,对于获得dsRNA具体是哪种病毒,还得通过其他的研究手段进一步确定。从G3、S8、T4和H74菌株提取到的dsRNA,琼脂糖凝胶电泳均观察到1条dsRNA条带,序列分析和Blast比对发现,仅菌株H74携带AlRV1一种病毒,而G3、S8、T4携带至少两种病毒,G3菌株携带的病毒与Totiviridae的AaVV1、CmRV和Uncultured totivirus 存在序列同源性;S8菌株携带的一种病毒与Totiviridae的AaVV1、CmRV、 BmVV2存在序列同源性,另一种病毒则与Partitiviridae的UvNV-1存在同源性,两种病毒分属于不同的科;T4菌株的一种病毒与Tymoviridae的TpMV1的序列同源性为99%,而有三段片段经Blast比对未找到有同源性的序列,可能是未知新病毒的序列。对于提取到两条dsRNA带的AS24和H63菌株, AS24的大片段dsRNA-L携带的病毒与已报道的Totiviridae的HvV 190S、BmV1存在序列同源性;而小片段dsRNA-S携带的病毒与Partitivirus病毒的AtPV1、PVLaPV10、ENaPV8存在序列同源性,分属于不同科的两种病毒。H63菌株同样观察到两条dsRNA条带,两条dsRNA分别对应于Chrysoviridae的AaCV1的RNA1-4,是一种病毒的不同组分;另外还检测到与Narnaviridae的成员ENaNV27存在同源性片段。通过对提取到的dsRNA序列分析和blast比对进一步表明,番茄早疫病菌不同分离物携带多种病毒,检测到的病毒分属于Totiviridae、Partitiviridae、Chrysoviridae、Tymoviridae和Narnaviridae,不仅存在多样性,而且存在复合侵染现象,其中有些病毒是已经报道的病毒或者是其新的株系,有些还可能是未被揭示的新病毒。

表1 测得序列BLAST比对

4 结 论

番茄早疫病菌菌株携带 dsRNA 的概率在22.5%左右。携带的dsRNA存在多样性。番茄早疫病菌菌株携带的病毒也存在多样性,不仅携带多种病毒,而且存在复合侵染现象,已经检测到的病毒分属于Totiviridae、Partitiviridae、Tymoviridae、Tymoviridae和Narnaviridae。