鹰嘴豆种子代谢产物的GC-MS分析

王 威,徐 乐,樊艳星,王 帆,马艳明,唐中华

(1.新疆农业科学院农作物品种资源研究所,乌鲁木齐 830091;2.新疆农业科学院,乌鲁木齐 830091;3.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨 150040)

0 引 言

【研究意义】鹰嘴豆(CicerarietinumL.)为一年生或多年生草本植物,在豆科类作物中居第3位,栽培地区主要分布于地中海沿岸、亚洲、非洲、美洲等地。鹰嘴豆是一种适宜在冷凉地区生长的豆类作物,鹰嘴豆在我国新疆、青海、甘肃种植较多,内蒙古也有少部分地区种植。鹰嘴豆具有极其丰富的营养价值和药用价值。鹰嘴豆中含有人类所需六大营养素,富含多种植物蛋白和氨基酸、维生素、粗纤维及钙、镁、铁、铜、锌、锰、锶等微量元素等成分[1-5],具有很高的食用价值。此外,鹰嘴豆中富含大豆肽、异黄酮等物质[6]。牛磺酸[11],属有机酸,可以调节体内微量元素的平衡,促进动物的健康,保护机体的正常功能。牛磺酸是动物正常发育所必需的,当牛磺酸缺乏时,生长、组织分化和免疫发育都会出现缺陷;奎尼酸[12],具有降血脂的生物活性。鹰嘴豆的脂质总含量为4.5～6.0 g/100 g[13]。其中脂肪酸主要为亚油酸(47.30%),油酸(36.90%),α-亚麻酸(2.35%),棕榈酸(9.51%)和硬脂酸(1.57%)[14]。与豌豆、蚕豆、绿豆、赤豆、黑豆和黄豆相比,鹰嘴豆中油酸的相对含量最高,总不饱和脂肪酸含量高达86.55%,α-亚麻酸和硬脂酸的相对含量最低。不饱和脂肪酸具"高油酸、低α-亚麻酸"的组成特点[15]。鹰嘴豆中的两种多不饱和脂肪酸(亚油酸和油酸)约占鹰嘴豆总脂肪量50%～60%[16]。鹰嘴豆富含植物蛋白和10多种氨基酸[17-19],每100 g干鹰嘴豆中蛋白质含量为8.9 g,远高于山药、燕麦、苦荞和马铃薯;每100 g蛋白质含谷氨酸17.3 g、亮氨酸8.7 g、赖氨酸7.2 g。鹰嘴豆的蛋白质功效比值、生物利用价值和消化吸收率指标,远远高于其它豆类[19]。每100 g干鹰嘴豆中碳水化合物含量为27.4 g[18]。如:单糖、双糖、低聚糖、多糖,以及不能消化吸收的无效碳水化合物如:纤维素。鹰嘴豆淀粉含量高于黑豆(33.6%)和马铃薯(15%)[19]。与小麦等谷物相比鹰嘴豆淀粉含量略低,但其种子中直链淀粉含量较高(鹰嘴豆30%～40%,小麦25%)[20]。DF是鹰嘴豆的精华部分,鹰嘴豆总DF含量为18～22 g/100g,DF浓度是谷类或油籽豆类的两倍以上[21]。分为可溶性和不可溶性膳食纤维[22],可溶性膳食纤维约占鹰嘴豆种子重量的4.8%,不可溶膳食纤维占10.18%[23]。其中乙醇胺[24]在哺乳动物中具有多种免疫功能;肉桂醇[25]有抗炎、抗氧化等作用。Pittaway J K[26]称膳食中添加鹰嘴豆可以降低总血清胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平。儿茶素[27]具有抗氧化、清除自由基、抑制脂质过氧化、提高膜稳定性等活性,毒扁豆碱[28]和山柰酚[29]亦有一定的疗效。研究分析鹰嘴豆品种之间代谢产物的GC-MS差异,对鹰嘴豆产品的开发有重要意义。【前人研究进展】吴霞等[7]应用GC-MS分析技术对鹰嘴豆中弱极性成分进行研究,从中鉴定出了以脂肪酸为主的22个化合物;高鹏等[8]利用GC-MS法对鹰嘴豆脂肪酸组成及含量进行了分析测定结果表明,从鹰嘴豆油中鉴定出 5种脂肪酸,鹰嘴豆油中不饱和脂肪酸含量均达到 80%以上;塔西买买提·吐尔汗[9]通过 GC-MS分析,发现鹰嘴豆油最主要的化学成分为亚油酸;赵华杰等[10]用GC-MS法从鹰嘴豆豆浆中检测到不饱和脂肪酸氧化生成的31种小分子挥发性成分。【本研究切入点】代谢组学主要是对动植物体内的代谢产物进行定量、定性分析,是通过高通量检测和统计学方法研究动植物体内代谢规律。目前利用 GC-MS技术对鹰嘴豆初级代谢产物进行代谢组学分析的报道较少。需研究鹰嘴豆品种之间代谢物质的差异。【拟解决的关键问题】通过非靶向代谢组学,研究10个不同来源的鹰嘴豆品种种子的代谢产物,分析不同品种的代谢差异,为鹰嘴豆食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

参试材料为近年来国家作物种质资源库(新疆分库)收集保存的国内外鹰嘴豆品种10个,来自2021年在新疆农业科学院综合试验场种植收获的种子。 表1

表1 参试鹰嘴豆品种

1.2 方 法

1.2.1 样品制备

采用GC-MS(气相色谱-质谱联用分析方法)进行代谢组学分析,每品种3次重复。使用研钵将种子研磨成细粉,取60 mg样品转移到1.5 mL管中,加入360 μL甲醇(-20℃预冷)和40 μL 2-L-氯-苯丙氨酸提取代谢物,涡旋振荡2 min,超声处理30 min。 加入200 μL氯仿和400 μL水,再次超声处理30 min。4℃下140 000 r/min离心10 min。将上清液转移至玻璃瓶中,自然蒸发至干。将干燥的残余物重新溶解于80 μL甲氧基胺吡啶溶液(15 mg/mL)中并在37℃下孵育90 min。随后,将80 μL等分试样的BSTFA(包括1%TMCS)和20 μL加入混合物中,涡旋2 min,在70℃下孵育60 min。将溶液以12 000 r/min离心5 min除去沉淀物,将上清液转移到玻璃瓶中。

1.2.2 基于GC-MS的代谢组学

将每重复1 μL试样的溶液以无分流模式注入Agilent 7890A-5975C GC-MS系统(Agilent,USA)。在非极性DB-5毛细管柱(30 m×250 μm内径,J&W Scientific,Folsom,CA)上以高纯度氦气作为载气以1.0 mL/min的恒定流速进行分离。GC温度编程从60℃开始,以8℃/min的速率升高至125℃,接着以4℃/min的速率升高至210℃,再以5℃/min的速率到270℃,最后以10℃/min的速率升高至305℃,在305℃下保持3 min。 电子碰撞(EI)离子源保持在260℃,能量为-70 eV。以每秒 20个光谱的速率,50～600的全扫描模式下获得质谱数据。

色谱分离在Ultra-Performance LC(UPLC)系统(Waters,Japan)上进行,使用LC-20AD泵,温度控制器,柱温箱,SIL-20A自动进样器(Waters,Japan)和ACQUITY UPLC BEH C18柱(使用具有在线过滤器并保持在25℃的1.7 μm,2.1 mm×50 mm)。 UPLC测定中的流动相由(A)水和(B)乙腈组成。洗脱程序优化如下:30%B(0～4.5 min),30%～60%B(4.5～6 min),60%～90%B(6～6.5 min),90%B(6.5～7.5 min),90%～30%B(7.5～8 min),30%B(8～10 min)。流速为0.25 mL/min,注射体积为5 μL。在配备有正离子检测模式的电喷雾电离(ESI)源的QTRAP 5500离子阱质谱仪(AB SCIEX,USA)上进行串联质谱检测。

1.3 数据处理

使用Agilent GC/MS 5975数据分析软件将原始GC-MS数据转换成CDF格式(Channel Definition Format,NetCDF),随后由XCMS(www.bioconductor.org)处理。每种代谢物以标准化的峰面积表示。将标准化数据导入SIMCA-P软件(版本11.0,http://www.umetrics.com/simca)进行多变量统计分析,用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。使用从PLS-DA模型获得统计学显著性阈值来鉴定鉴别代谢物,并通过t-检验分析进一步验证。选择VIP值大于1.0且P值低于0.05(阈值)的代谢物作为不同类别样品之间的区别代谢物。

2 结果与分析

2.1 鹰嘴豆种子代谢产物类别

研究表明,所测定的化合物共分为有机酸类、脂肪酸类、氨基酸类、糖类、醇类、酚类以及含氮类等几大类化合物。有机酸衍生物36种,脂肪酸衍生物12种,氨基酸衍生物36种,糖类衍生物5种,醇类衍生物10种,酚类化合物8种,含氮化合物16种,其他化合物23种。表2

2.2 鹰嘴豆种子代谢产物的聚类

研究表明,将化合物的Q值将鹰嘴豆的品种分为4小类。10个不同的鹰嘴豆品种均含有大量的酸类、糖醇类以及含氮类等几大类化合物,氨基酸类及其衍生物分布相对较少。其中,第Ⅳ类的D2016-10作为单独的一小类其化合物分布不同于其他品种,相较于其他9个品种,含有较多的氨基酸类及其衍生物的积累,以及极少的糖类积累;第Ⅰ类的YZD103和YZD99 2个品种作为一小类积累较多的脂肪酸类、醇类和含氮类化合物,与第Ⅲ类的YZD06、D2016-12和D2016-11 3个品种类似;第Ⅱ类的YZD86、YZD01、D2016-2和YZD80 4个品种包含的化合物种类及含量较多,涉及到有机酸、脂肪酸、糖醇类、含氮类以及酚类化合物的分布。

表2 鹰嘴豆种子的甲醇提取物中鉴定的主要成分比较

续表2 鹰嘴豆种子的甲醇提取物中鉴定的主要成分比较

续表2 鹰嘴豆种子的甲醇提取物中鉴定的主要成分比较

酸类化合物富集主要包括有机酸和脂肪酸。其中,D2016-2、D2016-10、YZD86、YZD06和YZD01等5个品种积累较多的酸类化合物,其中除D2016-10以外其余4个品种明显积累较多的脂肪酸类化合物;除此之外,YZD80极为特殊,其富含的酸类物质极少,只有极个别的酸类化合物含量较多,体现为肌氨酸酐、奎尼酸、吲哚乙酸和正辛酸等几种。

氨基酸类及其衍生物富集类似于酸类物质的分布。其中,大多数的鹰嘴豆品种均含有较高含量的氨基酸及其衍生物类的化合物,除编号YZD80之外。此外,10个鹰嘴豆品种含有较高含量的几种固有的氨基酸种类,包括脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸以及组氨酸等几种必需氨基酸,但D2016-10和YZD80 2个品种含量明显低于其他品种。YZD80品种其含有的较高含量的氨基酸类化合物为丝氨酸、谷氨酸、乙酰基亮氨酸、羟基色氨酸和脯氨酰胺等氨基酸类化合物。而D2016-10则富集异丁胺、丙二胺、酮缬氨酸、酮代异亮氨酸、谷氨酰胺、羟化瓜氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、乙酰赖氨酸、酪氨酸以及甲基组胺等化合物,以衍生物类为主。

糖醇类及其衍生物积累包括糖类和醇类。大多数的品种均含有较高含量的糖醇类化合物,并以醇类化合物为主,YZD80除外。10个品种均含有固定的几种化合物,分别为乙醇胺、丙二醇和甘油等,但D2016-10和YZD80 2个品种其含量明显较低,尤其是YZD80。其中,D2016-10主要包括脱水葡萄糖、儿茶酚和肉桂醇等化合物,而YZD80主要体现为半乳糖胺和葡糖胺等糖类衍生物含量较高。此外,D2016-2、YZD06和YZ86还包含脱水葡萄糖、儿茶酚和肉桂醇等化合物,类似于D2016-10,但含量均低于D2016-10。D2016-12、YZD103和YZD99 3个品种还富集到较高含量的半乳糖胺、苯甲醇和葡萄糖醇等物质。

图1 GC-MS提取的10种鹰嘴豆品种的代谢物谱的Q值的分级聚类Fig.1 hierarchical cluster analysis of Q value of metabolite spectrum of 10 chickpea germplasm extracted by GC-MS

D2106-2、YZD01和YZD06 3个品种测定到的两大类为酚类物质和含氮类化合物含量较高。10个品种均含有烷胺和脱氧鸟苷,但D2016-10和YZD80含量明显较低,其中D2016-10积累较多的色胺、脱硫生物素、苯肼和氨基嘌呤等化合物,而YZD80则含有较高的多巴胺和亚精胺等化合物。此外,除D2016-2和D2016-10 2个品种外,其他品种均含有较高的多巴胺。

D2016-10和YZD80 2个品种化合物积累明显与其他8个品种有显著差异,尤其是YZD80,8个品种针对每一大类的化合物均含有相同的某几种化合物的分布,而D2016-10和YZD80则积累自身特定的较高的化合物含量,而与其他8种相同累积的化合物的含量明显偏少。但2个品种所积累情况完全不同,因此二者存在各自的特异性。图1,图2

3 讨 论

3.1 GC-MS分析方法的应用

近年来,国内对气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的应用研究比较广泛,在中医药[30]、水质[31]、农药残留[32]、肉制品、果蔬等食品风味[33]、石油化工[34]等领域的检测均有应用。GC-MS在鹰嘴豆的检测分析也有报道,杨柳等[35]用顶空固相微萃取-气质联用技术(HS-SPME-GC-MS)对鹰嘴豆纳豆挥发性成分进行了测定与分析。赵华杰等[10]采用减压蒸馏与固相萃取联用的方式提取鹰嘴豆豆浆中的挥发性成分,并用气相色谱-质谱联用仪进行成分的分析鉴定,以峰面积归一化法对各成分进行定量。塔西买买提·吐尔汗[9]对迪西型鹰嘴豆油进行物理化学分析和GC-MS分析,确定了鹰嘴豆油最主要的化学成分为亚油酸。高鹏等[8]采用索氏提取法提取了来自不同产地的鹰嘴豆中的油,经甲酯化处理利用GC-MS法对其脂肪酸组成及含量进行了分析测定。吴霞等[7]应用气相色谱-质谱分析技术,对鹰嘴豆中弱极性成分进行了研究。

3.2 鹰嘴豆代谢组分的营养功能

鹰嘴豆中的糖类主要包括半乳糖、核糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖等,具有抗氧化、抗疲劳和调节胆固醇等生理活性[36];鹰嘴豆蛋白质含量较为丰富,约为12.6%～30.5%,高于核桃、燕麦等多种谷物[19],且多为优质蛋白,具有抗氧化、抗衰老等活性[37]。鹰嘴豆含有的氨基酸种类较多,共18种,主要包括亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸等。安馨等[38]选用新疆木垒县的鹰嘴豆为原料,采用WHO/FAO理想蛋白质氨基酸组成模式分析测定鹰嘴豆中的氨基酸种类与含量发现,必需氨基酸中亮氨酸的含量最高,约为70.0 mg/g,其次为苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸,非必需氨基酸中谷氨酸含量最高,约为108.0 mg/g。鹰嘴豆中还富含亚油酸、十八烯酸等大量的不饱和脂肪酸,作为衡量食物营养价值重要参考指标之一的亚油酸含量最高,约为47.3%,因其能够发挥预防糖尿病等功效,使得鹰嘴豆的食用和药用价值得以提高[39]。鹰嘴豆还含有多种维生素类物质,主要包括硫胺素、核黄素、VA、VC和VE等[40];此外,鹰嘴豆中铁、锌、镁、钙、钾以及硒等微量元素较为丰富,对于组成生物大分子,维持机体正常的生命活动也发挥着重要的作用[41]。

3.3 鹰嘴豆的应用价值

钱宗耀等[42]采用GC-MS技术,对市售9种豆类(鹰嘴豆、黄豆、青豆、花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆、黑豆、红豆)中的脂肪酸组分进行含量测定,结果表明,9种豆类样品脂肪酸组分及含量均有差异,其中青豆的总脂肪含量最高,鹰嘴豆的不饱和脂肪酸含量最高。杨美娟等[43]对鹰嘴豆中蛋白质、含油率、脂肪酸等进行检测,认为鹰嘴豆蛋白质含量丰富,含油率较低,不饱和脂肪酸含量高,具有降低胆固醇、促进新陈代谢、预防动脉粥样硬化的功效。孙凤等[44]采用GC-MS法分析鹰嘴豆脂肪酸成分,发现鹰嘴豆脂肪酸种类特别丰富,主要含有13种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸占83.5%,油酸、亚油酸含量较多。

4 结 论

从10种鹰嘴豆供试品种中检测到146种化合物,主要包含机酸类、脂肪酸类、氨基酸类、糖类、醇类、酚类以及含氮类等七大类功能不同的物质;代谢产物经热图聚类可将10个鹰嘴豆品种分为4个代谢产物不同的小类,其中8个品种针对每一大类的化合物均含有相同的某几种化合物的分布,而D2016-10和YZD80则积累自身特定的较高的化合物含量,较其他8种相同累积的化合物的含量明显偏少,且该2个品种所积累情况完全不同,二者存在各自代谢产物的特异性。