基于GC-MS技术对不同香型白酒的判别分析

朱开宪，胡 雪，邓 静，吴华昌，钱 宇，赵金松

（1.四川旅游学院烹饪科学四川省高等学校重点实验室，四川 成都 610100；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；3.四川轻化工大学生物工程学院，四川 自贡 643000）

中国白酒的香型在1979年第三届全国评酒会上，就初步划分为浓香、清香、酱香、米香和其他5种香型[1]。不同的香型白酒是由于酿造工艺和生产原料等因素不同，这些因素共同决定了白酒中风味物质组成、含量，从而形成了不同香型的白酒[2-5]。在此后经过30多年的发展，白酒的香型在原有的5种香型之上，又陆续出现了特香型、芝麻香型、凤香型等其他香型，到目前为止，包括老白干香型、馥郁香型已增加至12种[6-7]。

不同香型白酒的风味物质在种类和数量上具有较大的区别，例如：浓香型的主体香味成分是己酸乙酯[8-9]。己酸乙酯的高含量、低阈值，决定了这类香型白酒的主要风味特征；清香型白酒主体香气表现为乙酸乙酯为主、乳酸乙酯为辅的清雅、纯正、协调的复合香气，幽雅舒适[10-12]；酱香型白酒的主体香味成分至今尚无定论[13-15]，现有4-乙基愈创木酚说、吡嗪类化合物及加热香气说、呋喃类和吡喃类化合物及其衍生物说、10种特征香味成分说等多种说法。凤香型白酒的特征香气是以乙酸乙酯为主、一定量的己酸乙酯为辅的复合香气[16-17]。不同的香型的白酒之间的主体香具有一定的差异。目前，多种检测技术已经在酒类饮料中广泛应用，主要涉及质谱技术、光谱技术和其他技术。王丽花等[18]对白酒风味成分与感官评价的研究进展进行了报道。李贺贺等[19]利用气相色谱-燃烧炉-同位素比值质谱法对不同的酿造方法的白酒进行区分。YU H等[20]利用原子吸收光谱法结合偏最小二乘法的化学计量的方法对不同产地的米酒进行判定。孙文佳等[21]采用电子舌技术与多元统计学的方法相结合，对豉香型白酒的滋味品质评价分析，并且利用电子舌对同一产地不同品牌的豉香型白酒做出了较好的分类判别。杨雯懿等[22]通过电感耦合等离子体串联质谱法对白酒进行聚类分析。李艳敏等[23]利用5个不同产地清香型白酒中的12种重要的风味物质进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。孙宗保等[24]利用超高效液相色谱-高分辨质谱技术对白酒基酒等级进行了判别研究。

为了鉴定不同香型白酒中的特征香气物质，准确、有效地对不同香型白酒进行香气评价，本研究通过气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术对5种典型香型白酒的挥发性风味成分进行分析，并结合主成分分析、聚类分析（cluster analysis，CA）及偏最小二乘法判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等化学计量学手段对检测结果进行分析，旨在对不同白酒香型的识别和分类提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

5个香型的酒样：兼香型酒样（口子窖）（编号为KZJ-1～KZJ-4，酒精度分别为46%vol、46%vol、50%vol、52%vol）4瓶、酱香型酒样（郎酒）（编号为LJ-1～LJ-3，酒精度均为53%vol）3瓶、凤香型酒样（西凤）（编号为XF-1～XF-3，酒精度均为52%vol）3瓶、浓香型酒样（泸州老窖）（编号为LZLG-1～LZLG-4，酒精度均为52%vol）4瓶，米香型酒样（三花酒）（编号为SHJ-1，酒精度为52%vol）1瓶。

1.1.2 试剂

正丙醇、仲丁醇、正丁醇、2-甲基丙醇、乙酸乙酯、乙酸、异戊醛、2-戊酮、丙酸乙酯、异戊醇、正戊醇、丁酸乙酯、正己醇、戊酸乙酯、己酸、己酸乙酯、己醛二乙缩醛、庚酸乙酯、己酸丁酯、丙酸、丁酸、庚酸、辛酸、3-糠醛、叔戊醇、2-乙基丁酸、乙缩醛、乳酸乙酯、乙酸正戊酯、无水乙醇、异戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁醛二乙缩醛、乙酸己酯、己酸己酯、十六酸乙酯、己酸异丁酯、己酸丙酯、亚油酸乙酯（纯度均＞99%）：上海麦克林生化科技有限公司；C7～C40正构烷烃：北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ8000三重四极杆气相色谱质谱仪、AI1310多功能自动进样器：美国Thermo Fisher Scientific公司；HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 白酒挥发性风味成分的检测

采用GC-MS法检测白酒中的挥发性风味成分。

GC条件：初始温度为40 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升高至120 ℃，保持1 min，以40 ℃/min速率升高至290 ℃；进样口温度250 ℃；进样方式为直接进样；进样量1 μL。

MS条件：传输线温度为280 ℃；电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；扫描质量范围为39～550 m/z。

定性定量方法：对酒样中的化合物的定性主要采用保留指数对比和质谱库检索对比两种方式。将自动识别的色谱峰与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）12质谱库进行对比，再手动的筛选出正、反匹配度＞800，可能性＞90%的色谱峰，并且保证未知化合物的保留时间与标准样品的保留时间之间在5 s以内，则认为是同一种物质。白酒中风味成分的定量分析方法参考国家标准GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

1.3.2 数据处理

利用SPSS 22.0对数据进行化学计量学分析，SIMCA 13.0、MetaboAnalyst 5.0、Origin 2018软件对测定数据进行整理统计和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同香型白酒挥发性香气物质GC-MS分析

白酒酒样挥发性风味成分的检测均采用GC-MS方法，以ALS自动进样器直接进样的方式，对5种香型15个样品香气组分进行定性和定量研究，GC-MS分析总离子流色谱图见图1，挥发性风味成分含量的检测结果见表1。由图1和表1可知，5种香型15个白酒样品共检测出38种挥发性风味成分，包括醇类8种，酯类17种，酸类7种，醛酮类6种。

图1 不同香型白酒样品中挥发性风味成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion flow chromatogram of volatile flavor compounds in different flavor-type Baijiu samples analysis by GC-MS

由表1可知，不同香型的白酒在发酵过程中产生的醇类、醛类、酸类、酯类各不相同，形成了独具特色的风味，如己酸乙酯在浓香型白酒中含量最高，大于1 000 mg/L，其余酒样中的含量相对较低；酱香型（LJ）白酒中的乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量在1 500 mg/L和1400 mg/L左右；兼香型（KZJ）白酒中的乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量均在700 mg/L左右；凤香型（XF）白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量分别为800 mg/L和700 mg/L、浓香型白酒（LZLJ）中这两种酯类含量分别为800 mg/L和500 mg/L；米香型（SHJ）白酒中的乳酸乙酯含量分别为200 mg/L和800 mg/L。浓香型和凤香型白酒酒样中的己酸乙酯相对于其他香型更加高，其中米香型的三花酒中的己酸乙酯的含量仅为2.49 mg/L；以米香型为代表的三花酒中含量较高的酯类为乙酸乙酯和乳酸乙酯，这与沈怡方[25]关于白酒风味质量形成的主要因素分析一致。

表1 不同香型白酒酒样中挥发性风味成分含量测定结果Table 1 Determination results of volatile flavor compounds contents in different flavor-type Baijiu samples mg/L

通过对不同香型白酒中的风味物质进行分析，结果表明不同香型白酒中的挥发性风味成分含量和数量差异较大，因此利用挥发性风味成分间的差异对不同香型白酒的分类具有一定的参考价值。

2.2 不同香型白酒的挥发性风味成分聚类分析

白酒发酵过程中在微生物的作用下除了会产生大量的醇类和酸类物质外，还会产生大量的酯类物质，一部分由有机酸和醇类物质在一定条件下生成，另一部分也可由梭菌属微生物合成[19-21]。众所周知，酯类物质是白酒中的重要物质，是白酒香气的主体，其中乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯更是被誉为浓香型白酒中的“四大酯”[26-30]。对不同香型的酒样进行聚类分析，结果见图2。

图2 不同香型白酒样品中挥发性风味物质的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of volatile flavor compounds in different flavor-type Baijiu samples

由图2可知，通过聚类分析5种不同香型的白酒被分为五类，其中，在5个不同香型得酒样里酱香型酒样中的风味物质差异相较于其他四种香型（兼香型、米香型、凤香型、浓香型）的差异更大。5个香型白酒首先被分为两个大类，其中兼香型、米香型、凤香型、浓香型这四种香型白酒被分为第一个大类，酱香型白酒为第二个大类。其中第一个大类由口子窖为代表的兼香型的4个酒样KZJ-1、KZJ-2、KZJ-3、KZJ-4和以三花酒为代表的米香型的酒样SHJ-1以及以凤香型为代表的3个酒样XF-1、XF-2、XF-3和以泸州老窖为浓香型代表的4个酒样LZLJ-1、LZLJ-2、LZLJ-3、LZLJ-4，以上四种香型为第一大类。以酱香型为代表的3个酒样LJ-1、LJ-2、LJ-3单独聚集为一类，组成了第二大类。其中第一大类的酒样又单独的以各自的香型聚集为一类，分为四个小类。结果表明，经过聚类分析后的5种不同香型的酒样都能单独的聚集为5类，各自的香型聚集在一起，在一定程度上说明聚类分析结合酒样中的风味物质对不同香型酒样的区分具有一定的指导意义。

2.3 不同香型白酒挥发性风味成分主成分分析

利用聚类分析中的各酒样中的乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯的含量进行主成分分析。在进行主成分分析之前，首先对5种香型的酒样利用相关系数矩阵做适应性检验，结果表明，所选的风味物质间呈现显著相关（P＜0.05），说明酒样中的物质相关性较强，能够用PCA对其进行主成分分析。取各个酒样中在前3个主成分得分做三维和二维的得分散点图，结果见图3。由图3可知，5个不同香型的酒样在二维和三维的得分散点图中都能有效的分开，没有发生重叠的现象。从图3b～c的二维散点图中可以看出，兼香型的口子窖（KZJ）和米香型的三花酒（SHJ）相距最近；凤香型的西凤（XF）和浓香型的泸州老窖（LZLJ）距离较近；酱香型的郎酒（LJ）与其他四个香型的酒样差异最大相距较远，这与聚类结果一致，在聚类结果中酱香型的郎酒（LJ）单独聚集为一类，说明聚类分析和主成分分析都能对不同香型的酒样进行区分和鉴别，两种化学计量学统计方法对今后的香型的判别具有一定的指导意义。

图3 不同香型白酒样品前3个主成分的三维（a）及二维（b、c）散点图Fig.3 Three-dimensional (a) and two-dimensional (b,c) scatter plots of distribution of the first 3 principal components in different flavor-type Baijiu samples

2.4 不同香型白酒的偏最小二乘法判别分析

在主成分分析的基础上，对5个不同香型的白酒进行偏最小二乘法判别分析，在判别分析中提取的2个成分即可反映总体变量的99.9%的信息，说明能有效的代表酒样中大部分信息，利用5个不同产地的酒样在这2个成分中的得分做散点图，结果见图4。由图4可知，每一个香型的酒样的组心质都相互分开，说明每一个香型存在着明显的差异；所有酒样的散点图都没有发生重叠，并且同一种香型的酒样聚集在一起，说明同一种香型的酒样在化合物的含量与数量上存在一定的相似。

图4 不同香型白酒酒样偏最小二乘法判别分析散点图Fig.4 Scatter plots of partial least squares discriminant analysis of different flavor-type Baijiu samples

在5个不同香型的酒样中随机的挑选1个酒样用做“测试集”，剩余的酒样当作“训练集”。将“测试集”和“训练集”的酒样的判定出的香型结果与实际香型作对比，判定结果见表2。由表2可知，每一个香型酒样中的“测试集”和“训练集”的正确率均为100%，说明所建立的判别模型适用于不同香型的白酒之间的区分，同时也表明，实验中所选取的化合物和化学计量学的方法相结合能有效对不同香型白酒酒样进行判定，对不同香型白酒判定具有一定的指导意义。

表2 不同香型白酒酒样分类结果Table 2 Classification results of different flavor-type Baijiu samples

3 结论

利用聚类分析、主成分分析、判别分析等多种化学计量学的手段，结合四种酯类的含量初步的将5种不同香型的酒样进行了分类，聚类分析能有效的将5种不同香型的酒样分成5类；主成分分析中的前3个主成分能基本上表现出酒样中所带的所有信息，利用15个酒样在三维和二维的得分上做散点图，散点图中也能发现不同的香型各自聚集；主成分分析和聚类分析在不同香型的酒样间的聚类和间距基本一致；判别分析中的2个成分能很好的代表酒样中的基本信息，5种香型的组心质都相互分离，没有重合，将“测试集”和“训练集”的判定结果与实际结果相比较，正确率均为100%。