结核分枝杆菌感染过程中宿主抗菌肽LL-37免疫调控功能的研究进展

张志芳，徐咏梅，万珈旭，高 妍，陈 祥,，徐正中,，焦新安,

由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的结核病是一种重要的人兽共患病，世界卫生组织在其发布的《2021年全球结核病报告》中指出，2020年全球新发结核病患者987万，约150万人死于结核病，结核病死亡人数十多年来首次出现增加[1]，结核病仍然是一个威胁全球公共卫生的重大问题。在过去的几十年中，耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)结核病(TB)的出现使结核病的防治越来越具有挑战性。

随着病原体对传统抗生素产生抗药性，合成和天然来源的抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)逐渐引起了人们的兴趣，这类分子的主要优势之一是它们能够杀死耐多药细菌。AMPs是一种具有天然免疫活性的小蛋白，是人体抵御病原体的第一道防线的组成部分，在机体中广泛存在，参与免疫调节和炎症反应。AMPs作为先天免疫效应分子的作用正在从单纯的内源性抗生素发展到参与宿主防御的第一道防线、调节局部炎症反应和激活适应性免疫的多功能介质[2]。LL-37是目前已知的唯一在人类中表达的抗菌肽，具有免疫调节作用，既有促炎功能又有抑炎功能[3]。LL-37也参与宿主对分枝杆菌感染的防御和先天免疫反应，结核感染期间血清中LL-37水平显著升高[4]。另有报道显示严重的结核病患者的M.tb感染部位出现LL-37低表达[5]，并且已有研究发现LL-37表达水平较低的人群对于结核病的易感性更高[6]，表明LL-37在机体针对M.tb感染的免疫防御中发挥重要作用。

1 Cathelicidin LL-37的概述

抗菌肽又名宿主防御肽，最早是在1980年由瑞典科学家 G.Boman在天蚕蛹中发现的一类阳离子小肽类物质[7]。哺乳动物存在两类抗菌肽：防御素家族和Cathelicidin家族[8]。Cathelicidins家族的抗菌肽包含1个C-端阳离子的抗菌结构，该结构域只有在整个肽的N-端“cathelin”部分被释放后才有活性[9]。虽然在哺乳动物中已经发现了很多Cathelicidin家族成员，但是在人类体内仅存在1个，即cathelieidin LL-37[10]。人cathelieidin LL-37含37个氨基酸(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIV-QRIKDFLRNLVPRTES)，因其N端前两个氨基酸残基是亮氨酸而得名LL-37[11]。Pro-LL-37(hCAP-18)是由人cathelicidin基因(CAMP)基因转录而来，具有生物活性的LL-37由其前体蛋白hCAP-18通过蛋白酶3胞外裂解而形成[12]。最初在中性粒细胞中发现LL-37，随后发现其在皮肤、肺和肠道的上皮细胞中也有表达[13]。此外，LL-37 是一种多功能蛋白，具有广谱的抗微生物、抗毒素活性和机体免疫调节作用，能够激活趋化性，连接宿主先天性免疫和获得性免疫，发挥免疫调节作用[14]。大多数AMPs通过破坏微生物膜的完整性来发挥作用，研究发现LL-37的阳离子疏水表面可以结合到细菌外膜的负电荷基团上，导致细菌细胞膜破坏，从而抑制病原菌在宿主细胞中存活。不仅如此，LL-37还可以作为一种免疫监测器，当LL-37被细菌及其产物诱导产生时，LL-37可以诱导趋化因子表达并且促进免疫细胞的迁移，从而控制细菌感染。随着近年抗菌肽研究的不断深入，LL-37更多的生物学功能被挖掘发现。

2 结核分枝杆菌感染过程中对于LL-37表达的免疫调控

很多体内外实验已证实M.tb能够诱导LL-37表达并发挥免疫调控功能。从目前的研究发现，M.tb可以诱导上皮细胞、人肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞来源的巨噬细胞等多种细胞中LL-37的表达[15]。研究发现BCG能以浓度依赖的方式显著诱导A549上皮细胞表达LL-37，并且ERK1/2和MAPK p38信号通路参与了BCG诱导LL-37表达的调控[16]。CAMP是在小鼠中与人抗菌肽LL-37相似的抗菌肽相关蛋白，在H37Rv以高剂量感染BALB/c小鼠气管后，诱导了CAMP基因的高表达[17]。LL-37的表达受到来自自身或者外界不同刺激的影响，维生素D3的活性形式1,25(OH)2D3也可以诱导巨噬细胞和呼吸道上皮细胞表达LL-37[18]。LL-37表达的诱导是由维生素D状态决定的，缺乏和不足的水平会导致结核病的不良反应，维生素D状态与结核病的相关性可能是LL-37表达上调和巨噬细胞活化的结果[19]。4-苯丁酸钠(PBA)用于治疗一系列的临床疾病，现被证明可与1α,25(OH)2D3协同作用上调细胞中CAMP的表达，抵抗M.tb的感染[20]。另外，M.tb介导的LL-37上调可能受NADPH/ROS信号通路的影响，细胞内活性氧(ROS)在BCG诱导的人上皮细胞LL-37表达中发挥重要的调控作用[21]。LL-37对NF-κB、NF-interleukin-6和AP-1等转录因子具有潜在的结合位点，这些转录因子也有可能参与调控分枝杆菌诱导的宿主细胞中的LL-37表达[22]。总之，这些证据表明多种信号分子在介导M.tb诱导的LL-37产生中起重要作用，值得我们深入探究。

另一方面，M.tb及其组分可能抑制LL-37的表达。Rode等的研究表明热灭活的M.tb可以通过TLR2信号传导来显著抑制树突状细胞中cathelicidin表达，维生素D可以抵消M.tb对cathelicidin的下调[23]。已有研究发现M.tb衍生的cAMP信号传导可调节M.tb感染巨噬细胞的cathelicidin水平，可抑制LL-37转录[24]。M.tb的一些组分也可以抑制宿主细胞LL-37的转录表达，比如M.tb脂蛋白LprE，LprE是一种结核感染发病中发挥至关重要作用的毒力因子，LprE通过TLR2-p38-CYP27B1-VDR信号通路抑制THP-1细胞中LL-37的表达，参与逃避宿主免疫反应从而促进胞内分枝杆菌存活[25]。M.tb的一些效应蛋白抑制LL-37的表达可能是结核分枝杆菌免疫逃逸策略之一，由于相关报道比较少，抑制LL-37表达的M.tb组分及机制还有待被研究。

3 结核分枝杆菌感染过程中LL-37的免疫杀伤及免疫调控功能

3.1 LL-37对于结核分枝杆菌的杀伤功能 人体细胞在感染M.tb时会产生高水平的LL-37，LL-37具有杀伤M.tb的活性，还能够有效降低分枝杆菌的胞内存活[26]。研究表明经LL-37处理的H37Rv细胞壁变薄、出芽或破裂、细胞质凝结，表明了外源性LL-37可以杀伤M.tb[27]。LL-37对M.tb生长的影响似乎呈剂量依赖性，使用200 μg/mL的LL-37处理后发现M.tb的CFU减少了75.7%，而20 μg/mL的LL-37使培养中的M.tb减少了52.4%，这表明LL-37影响M.tb的生长[28]。Vitamin D (1,25D3)诱导的抗分枝杆菌活性依赖于内源性CAMP的表达[29]，Liu等发现H37Ra感染单核细胞THP-1后，Vitamin D (1,25D3)处理细胞可以增强LL-37对M.tb的杀伤作用并且刺激LL-37 mRNA和蛋白的表达，且当cathelicidin被siRNA抑制时，M.tb的胞内增殖增强[30]。Adam等报道C57BL/6小鼠在滴鼻感染牛分枝杆菌卡介苗BCG后，肺组织中编码CAMP蛋白的Camp基因的转录水平显著上调，cathelicidin表达上调意味着对胞内BCG的杀伤增强[31]。这些研究表明，除了能在体内外环境中抑制分枝杆菌生长外，LL-37还表现出对H37Rv、H37Ra和BCG等不同类型M.tb的杀菌活性。另外，进一步的机制研究发现，牛分枝杆菌卡介苗BCG感染导致MyD88、pIRAK-4和p38在信号通路中表达水平升高，IRAK-4-p38的激活增加了NF-κB的核转位，随后诱导了Camp的表达，导致胞内BCG被杀伤，而抑制该诱导通路后又能增加分枝杆菌的存活率[32]。LL-37降低M.tb胞内存活背后的确切机制还需要进一步研究，鉴于对M.tb的杀伤作用，LL-37具有作为抗结核药物靶标的潜力。

3.2 LL-37的抗结核免疫调节功能 LL-37不仅能够直接对病原菌起到杀伤作用，而且能够调控免疫细胞防御功能，参与机体对病原菌的免疫调节。自噬正在成为一种抗菌防御机制的关键因素[33]，自噬是小鼠和人类巨噬细胞对抗M.tb的重要宿主防御机制，LL-37对于自噬体的积累及其与溶酶体的融合至关重要，已有研究数据证明，hCAP18/LL-37表达是增强诱导自噬相关基因表达所必需的[34]，LL-37影响细胞自噬并能调节细胞内的相关信号通路。LL-37介导的自噬激活涉及到P2RX7受体的信号转导，细胞内游离Ca2+，以及AMPK和PtdIns3K信号通路是LL-37介导的人巨噬细胞自噬的激活所必需的[35]。另有研究发现结核分枝杆菌脂蛋白LpqH能以TLR2依赖的方式激活抗菌肽介导的自噬，并且诱导LL-37杀死细胞内的M.tb[36]。由此可见，LL-37在感染过程中的免疫调控受到宿主细胞以及结核分枝杆菌相关蛋白等多方面因素的影响，在抗结核分枝杆菌感染的免疫反应中发挥关键作用。

LL-37有利于免疫细胞在感染部位募集，还可以作为有效的免疫调节剂发挥趋化因子和诱导细胞因子产生的作用。已经证明LL-37可以通过抑制NF-κB的核转位选择性地调节炎症反应的基因，从而导致TLR触发的转录反应的失调[37]。此外，LL-37能够抑制细菌组分刺激细胞产生炎症介质的能力，在A549人肺上皮细胞系中，LL-37可以降低LPS刺激IL-8和MCP-1产生的能力。结核病患者的LL-37浓度与疾病严重程度和免疫激活的临床显著变量之间存在相关性，血清LL-37含量可以作为全身免疫激活和宿主炎症环境的标志物，在结核病慢性感染过程中，LL-37浓度可作为免疫激活增强的标志[38]。

LL-37可能具有双重功能，在早期感染期间，它可能是一个由肺上皮细胞和肺泡巨噬细胞表达的重要因子，有助于控制分枝杆菌的生长，在感染晚期，它可能是一个抑制过度炎症的重要免疫调节因子[39]。在结核病感染的晚期，LL-37的免疫调节特性通过调节促炎和抗炎细胞因子的表达来改变巨噬细胞的反应，从而保护宿主细胞[40]。LL-37在抗结核分枝杆菌感染的免疫调节过程中发挥关键作用，在宿主中不仅有促炎的效应，还可以选择性地减少巨噬细胞促炎反应而产生相反的抑炎效果。但是，LL-37在M.tb感染过程中介导免疫调节活性的机制尚未被研究清楚。

4 LL-37在结核病诊断治疗中的应用

传统抗生素日益严重的耐药性问题和对新抗生素的需求刺激了AMPs作为人类治疗药物开发的兴起，其中一些药物如抗菌肽Pexiganan、MBI-594、MBI-226等已经进入II/III期临床试验，有研究认为这些产品在不久的将来也将占据相当大的市场份额。LL-37及其衍生物具有毒性低、与细胞作用时间短、不通过受体发挥作用的特点，不容易产生耐受性，可以开发成新型的抗菌药物在医药行业具有很好的应用前景[41]。另有研究发现，LL-37的表达水平在结核病患者和非结核病个体中存在显著差异，与正常健康受试者和革兰氏阳性或阴性细菌引起的肺炎患者相比，活动性肺结核病患者血清中LL-37的浓度显著升高[42]，活动性肺结核患者血液中LL-37基因表达水平也明显高于潜伏性肺结核和健康人群[43]。LL-37是活动性结核分枝杆菌感染的独立危险因素，LL-37的表达水平随着活动性结核感染病情严重程度的增加而增加，由于 LL-37高水平患者更易感染结核分枝杆菌而发生活动性结核分枝杆菌感染，提示LL-37可能可作为活动性结核分枝杆菌感染的生物学标志物[44]。活动性结核病患者和潜伏性肺结核患者的LL-37水平的这种微小差异可能是由于潜伏感染进展为活动性结核病的过程所致，活动性结核病状态下表达的LL-37水平升高，说明LL-37能够区分活动性结核病和其他结核病感染的状态，但是，还需要进一步的研究来评估这一生物标志物作为筛查工具来排除活动性结核病的作用[45]。有研究表明，肺结核患者LL-37上升或与机体代偿反应相关，认为LL-37可作为诊断结核病的潜在生物标志物[46]，但目前针对LL-37在结核病患者治疗中的诊断价值的研究较少。鉴于LL-37的表达水平与结核病的存在和结核病患者病情严重程度相关联，表明LL-37对肺结核患者有一定诊断预测价值，检测结核分枝杆菌感染患者血清LL-37水平可能有助于监测病情变化，或许可以将LL-37作为诊断靶标为结核病的临床治疗提供一些有价值的参考意见。

LL-37对于治疗结核病的研究还没有达到临床前试验阶段，但是大量实验数据证明在小鼠模型中LL-37能有效抑制M.tb的生长，小鼠使用LL-37给药处理1个月(3次/周)后，发现LL-37显著降低了小鼠肺组织中的M.tb载量，LL-37在结核病治疗中表现出良好潜力[27]。外源药物促进LL-37表达也为预防和治疗疾病提供了新的思路，活性维生素D是LL-37的有效诱导剂[47]。有报道显示，前列腺素E2可以通过前列腺素受体EP4抑制维生素D3诱导的hCAP18/LL-37的表达来降低宿主对M.tb的防御，EP4的一种拮抗剂CJ-023423可能用于结核病患者的辅助治疗[48]。4-苯丁酸钠(PBA)已被证明诱导LL-37的表达，在活动性结核病患者接受治疗时分别给药维生素D、PBA或两种药合用都有助于结核病患者临床恢复[49]，联合治疗可进一步抑制M.tb的生长，PBA和维生素D可能被证明是一种有效的结核病联合辅助治疗方法。由此可见，LL-37在结核病治疗方面有很大潜力，但是LL-37在体内治疗的安全性还有待进一步评估。

5 结 语

面对日益严峻的M.tb耐药问题，寻找新型抗结核药物的需求更加迫切。目前的研究发现，LL-37可作为结核病诊断的标志物，可能为结核感染的免疫诊断、重型结核病患者的风险预测提供新的线索。作为治疗结核病的候选药物，LL-37不仅对于M.tb在细胞内存活有影响，还具有免疫调节特性，可以介导宿主细胞的自噬和炎症反应，有利地调节免疫活性。有趣的是，Vitamin D (1,25D3)、PBA等药物可以通过诱导LL-37表达介导M.tb感染中对机体的保护，PBA对M.tb有抑菌作用，与Vitamin D (1,25D3)协同作用可调控巨噬细胞对感染的反应。M.tb感染后可诱导宿主细胞表达LL-37，然而LL-37的表达又能够被结核分枝杆菌相关组分所抑制，例如M.tb脂蛋白LprE，这可能是M.tb的一种逃避免疫反应的新机制。扩大范围筛选影响LL-37表达的M.tb效应分子，深入了解LL-37表达过程中的信号传导机制，将有助于对新型抗结核病药物的研发。尽管对LL-37及其在结核病中作用的了解越来越多，但还没有足够的证据来明确LL-37在结核中的具体作用，未来要加强对LL-37的临床研究，从而为结核病的治疗提供新的思路。

利益冲突：无