新疆维吾尔自治区喀什地区亚洲璃眼蜱携带病原菌研究

包子豪，张 琳，侯学霞，段立科,2，王远志，郝 琴

蜱属于节肢动物门(Arthropoda)蛛形纲(Arachida)寄螨目(Parasitiformes)蜱总科(Ixodoidea)，下设硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)和仅有一种存在于非洲南部的纳蜱科(Nuttalliellidae)[1]。目前，中国发现蜱类有硬蜱科和软蜱科两大类，共包含9属129种，约占全球蜱类总数的13%[2]。据报道，中国大陆地区自1982年起，已发现33种蜱类相关病原体，主要包括病毒、细菌、原生动物等[3]。新疆维吾尔自治区位于中国西北地区，地域广阔且地质地貌复杂多样，是中国各类蜱传疾病的重要自然疫源地。自20世纪50年代起，新疆地区已发现或记载的蜱类共2科9属45种，其中亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticumasiaticum)分布广泛，准噶尔盆地、塔里木盆地、东疆盆地等地均有报道[4]。喀什地区位于新疆西南端，与5个国家接壤，并有6个国家一类口岸对外开放，人流与物流来往频繁，十分适宜各种蜱传疾病的传播，且大多数蜱传疾病临床症状缺乏特异性，鉴别诊断有一定困难。本次研究涉及6种常见蜱传病原菌，包括伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferisensulato)、米氏疏螺旋体(Borreliamiyamotoi)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum)、贝纳柯克斯体(Coxiellaburnetii)、斑点热群立克次体(Spottedfevergrouprickettsia)、查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)，分别可引起莱姆病(Lyme disease)、回归热(relapsing fever)、人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)、Q热(Q fever)、斑点热(spotted fever)、人单核细胞埃立克体病(Human monocytic ehrlichiosis,HME)[5]。鉴于许多蜱传疾病的非特异性症状，了解喀什地区亚洲璃眼蜱所携带病原菌种类及感染状况对当地蜱传疾病的防控具有十分重要的意义。本研究基于高通量测序和PCR法就新疆喀什地区亚洲璃眼蜱及其携带细菌开展初步调查研究，为喀什地区蜱传病原体监测及蜱传疾病防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样本采集 在新疆维吾尔自治区喀什地区巴楚县选用布旗法收集游离蜱，置于通气、湿润的瓶中带回实验室，于解剖镜2～4倍视野下对蜱种分类鉴定后进行DNA的提取。

1.1.2 主要实验试剂 DNeasy Blood &Tissue Kit，凯杰企业管理(上海)有限公司产品；2×Taq PCR Master Mix(Dye,CW0682L)，江苏康为世纪生物科技有限公司产品；琼脂糖，法国Biowest公司产品；5×TBE缓冲液，北京索莱宝科技有限公司产品；GoldenView，北京艾德莱生物科技有限公司产品；100 bp Ladder DNA Marker，北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要实验仪器 组织研磨器G20/G50，北京金银杏生物科技有限公司产品；PCR仪LabCycler Standard P，德国Sensoquest公司产品；电泳仪、电泳槽EPS301/HE33，美国GE公司产品；高速冷冻离心机Centrifuge 5424 R，德国Eppendorf公司产品；恒温水浴箱TW8，德国JULABO公司产品；凝胶成像仪Geldoc XR+，美国Bio-rad公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 蜱种鉴定 根据蜱的形态学特征对蜱种进行初步鉴定，再对蜱的线粒体 16S rDNA进行检测[6]，通过测序分析准确鉴定蜱种。蜱的线粒体 16S rDNA引物及反应条件见表1。阳性PCR产物送交奥科鼎盛生物科技有限公司测序。序列使用NCBI的BLAST工具与GenBank中的参考序列进行比对分析。综合形态学特征，判断蜱的种类。

表1 蜱线粒体16S rDNA检测所用引物Tab.1 Target primers and PCR conditions of tick mitochondrial 16S rDNA

1.2.2 蜱基因组DNA提取 从342只蜱中随机选取114只蜱提取DNA，所有蜱标本用75%酒精浸泡3～5 min并充分洗涤后，再用超纯水漂洗3次，每管1只分装于1.5 mL EP管中，使用组织研磨器逐一对蜱分装样本进行研磨，采用DNeasy Blood &Tissue Kit 试剂盒提取基因组DNA，提取步骤参见试剂盒说明书。提取产物分装为两部分，一部分用于PCR检测，每管仅有单只蜱DNA，共114个样本，记为XK(新疆喀什)组，即单只组；另一部分用于高通量测序，每管混有3～4只蜱的DNA，共37个样本，记为K(喀什)组，即混合组。分装样本于-80 ℃备用。

1.2.3 16S rDNA V3-V4高变区的高通量测序及分析 将混合组(K组)送至百迈客生物科技有限公司进行高通量测序。测序基于 Illumina Novaseq 测序平台，使用双末端测序(Paired-End)法构建小片段文库。对原始测序序列进行质控，包括低质量过滤、长度过滤，得到高质量序列。将高质量序列进行聚类/去噪，将相似度97%以上的序列划分为一个操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)，并根据OTU的序列组成得到其物种分类。通过Alpha多样性分析研究单个样品内部的物种多样性，统计了各样品的Shannon及Simpson指数，利用 Mothur 软件和R语言工具依据各样品的测序量在不同测序深度时的Shannon指数(反映样品中微生物多样性的指数)绘制Shannon多样性指数稀释曲线，利用R语言工具依据各样本OTU数及注释到的物种数量绘制物种累积曲线图。基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的物种相对丰度水平并绘制物种丰度柱状图，确定喀什地区蜱携带的微生物种类及病原菌的感染状况。

1.2.4 常见蜱传病原菌的PCR检测 结合高通量测序结果，针对蜱种带菌特征及新疆常见蜱媒病原菌分布情况[3,6-9]，采用分子检测方法对单只组(XK组)进行6种病原菌检测(表2)。

表2 病原菌检测靶基因、引物及PCR反应条件Tab.2 Target genes,primers and PCR conditions of pathogens

1.2.5 PCR产物检测及一代测序分析 取5 μL PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。阳性产物送交奥科鼎盛生物科技有限公司测序。测得碱基序列使用NCBI的BLAST工具进行同源性比对分析，下载GenBank中目的基因相关的参考序列，与测得碱基序列共同进行系统发育分析。

使用MEGA 11.0软件，采用clustalW法对核苷酸序列进行比对，采用bootstrap=1 000的邻接算法(neighbor joining,NJ)对比对后序列进行聚类分析。

2 结 果

2.1 蜱的种类 本次实验共采集蜱342只，形态学鉴定如图1。所有蜱形态高度相似，初步鉴定均为璃眼蜱属。随机选取5只蜱进行16S rDNA序列分析比对，本次实验所采得蜱均为璃眼蜱属的亚洲璃眼蜱，详见图2。

1：雌蜱全身(背部)；2：雌蜱头部(背部)；3：雌蜱全身(腹部)；4：雌蜱头部(腹部)；5：雄蜱全身(背部)；6：雄蜱头部(背部)；7：雄蜱全身(腹部)；8：雄蜱头部(腹部) 图1 喀什地区亚洲璃眼蜱的形态 Fig.1 Morphology of Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

图2 喀什地区亚洲璃眼蜱16S rDNA序列聚类分析Fig.2 Cluster analysis of Hyalomma asiaticum asiaticum 16S rDNA from Kashgar Prefecture

2.2 亚洲璃眼蜱病原菌群落分析

2.2.1 16S rDNA V3-V4区测序结果及Alpha多样性分析 37个混合样本测序共得到高质量的clean reads 2 949 126条，每个样本的平均高质量clean reads数为79 706条；37个样本的细菌总OTU数为1 439个，平均每个样本OTU数为1 243个。样本Alpha多样性反映的是单个样品物种丰度及物种多样性，其中Shannon指数和Simpson指数用于衡量物种多样性。除K1外，其余样本多样性均较高(Simpson指数>0.80)，所有样本coverage指数均大于0.99，说明蜱样本文库中序列未被检出的概率低。Shannon多样性指数稀释曲线如图3，当曲线趋向平坦时，提示测序数据量足够大，特征种类不会再随测序量增加而增长。属水平物种累积曲线图如图4，红色箱型组成累积曲线，绿色箱型组成共有曲线，在一定范围内，当曲线趋于平缓，提示抽样充分，适合进行分析。

图3 喀什地区37个混合蜱样本的Shannon Index曲线Fig.3 Shannon index rarefaction curves of 37 mixed tick specimens from Kashgar Prefecture

图4 喀什地区37个混合蜱样本的属水平物种累积曲线图Fig.4 Genus level species accumulation curve of 37 mixed tick specimens from Kashgar Prefecture

2.2.2 样本群落结构分析 对37个混合样本携带的物种数量和丰度进行分析，基于OTU分析结果作门、纲、目、科、属、种水平下的物种丰度柱状图(图5)。37个样本在门水平下分析，至少含有29个门的微生物，其中变形菌门(Proteobacteria)在所有样本均有检出且含量最高，物种丰度为42.8%～83.1%。在纲水平下分析，至少含有73个纲的微生物，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)在所有样本中均有检出且含量最高，物种丰度为38.7%～81.5%。α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和螺旋体纲(Spirochaetia)在所有样本中也均有检出。在目水平下分析，至少含有173个目的微生物，立克次体目(Rickettsiales)和螺旋体目(Spirochaetales)在所有样本中均有检出，立克次体目物种丰度为0.5%～6.7%，螺旋体目物种丰度均较低，为0.02%～0.13%。有31个样本检出军团菌目(Legionellales)。在科水平下分析，至少含有306个科的微生物，螺旋体科(Spirochaetaceae)和立克次体科(Rickettsiaceae)在所有样本中均有检出，螺旋体科物种丰度与螺旋体目保持一致，立克次体科物种丰度为0.001%～0.046%，16个样本检出无形体科(Anaplasmataceae)，10个样本检出柯克斯体科(Coxiellaceae)。在属水平下分析，至少含有506个属的物种，无形体属(Anaplasma)、立克次体属(Rickettsia)、柯克斯体属(Coxiella)检出情况与其对应科水平一致，埃立克体属(Ehrlichia)和疏螺旋体属(Borrelia)未被检出。在种水平下分析，6种关注的病原菌中仅有1个样本检出贝纳柯克斯体，其余均未检出。

A：门水平物种丰度柱状图；B：纲水平物种丰度柱状图；C：目水平物种丰度柱状图；D：科水平物种丰度柱状图；E：属水平物种丰度柱状图；F：种水平物种丰度柱状图图5 喀什地区37个混合蜱样本的物种丰度柱状图Fig.5 Histogram of species abundance of 37 mixed tick specimens from Kashgar Prefecture

2.3 PCR检测结果 对XK组114只亚洲璃眼蜱样本DNA进行PCR检测，其中14只蜱检出伯氏疏螺旋体目的基因片段，7只蜱检出米氏疏螺旋体目的基因片段，3只蜱检出嗜吞噬细胞无形体目的基因片段，2只蜱检出贝纳柯克斯体目的基因片段，查菲埃立克体基因与斑点热群立克次体基因检测均为阴性。各蜱样本均不存在混合感染。详见图6。

A：伯氏疏螺旋体5S-23S基因间隔区；B：米氏疏螺旋体glpQ基因；C：嗜吞噬细胞无形体16S rDNA；D：贝纳柯克斯体IS1111基因；1-22为不同蜱样本；M为DNA marker；P为阳性对照；N为阴性对照。图6 喀什地区蜱样本PCR检测结果Fig.6 PCR results of tick samples from Kashgar Prefecture

2.3.1 伯氏疏螺旋体5S-23S基因间隔区序列分析 喀什地区亚洲璃眼蜱中伯氏疏螺旋体5S-23S基因间隔区序列通过BLAST比对分析，XK1与Genbank中Borreliellaafzelii同源性为100%；XK4与Borreliagarinii同源性为100%；XK20、XK21、XK28、XK29、XK36、XK37、XK40、XK44、XK45、XK47、XK56、XK60与Borreliavalaisiana同源性较高(99%～100%)。详见图7。

图7 喀什地区亚洲璃眼蜱中伯氏疏螺旋体5S-23S基因间隔区序列聚类分析Fig.7 Cluster analysis of the Borrelia burgdorferi sensu lato 5S-23S rDNA intergenic spacer in Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

2.3.2 米氏疏螺旋体glpQ基因序列分析 喀什地区亚洲璃眼蜱中米氏疏螺旋体glpQ基因序列通过BLAST比对分析，XK6、XK7、XK22、XK41、XK59、XK65、XK67与中国和俄罗斯的全沟硬蜱中米氏疏螺旋体的同源性较高。详见图8。

图8 喀什地区亚洲璃眼蜱中米氏疏螺旋体glpQ基因序列聚类分析Fig.8 Cluster analysis of the Borrelia miyamotoi glpQ gene in Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

2.3.3 嗜吞噬细胞无形体16S rDNA序列分析 喀什地区亚洲璃眼蜱中嗜吞噬细胞无形体16S rDNA序列通过BLAST比对分析，XK85与新疆的图兰扇头蜱中嗜吞噬细胞无形体的同源性较高，XK50、XK66与新疆的狗和璃眼蜱中嗜吞噬细胞无形体的同源性较高。详见图9。

图9 喀什地区亚洲璃眼蜱中嗜吞噬细胞无形体16S rDNA序列聚类分析Fig.9 Cluster analysis of Anaplasma phagocytophilum 16S rDNA in Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

2.3.4 贝纳柯克斯体IS1111基因序列分析 喀什地区亚洲璃眼蜱中贝纳柯克斯体IS1111基因序列通过BLAST比对分析，XK34、XK51与新疆的鼠、新疆和澳大利亚的人血中的贝纳柯克斯体同源性较高。详见图10。

图10 喀什地区亚洲璃眼蜱中贝纳柯克斯体IS1111基因序列聚类分析Fig.10 Cluster analysis of the Coxiella burnetii IS1111 gene in Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

3 讨 论

喀什地区位于新疆西南端，地处塔里木盆地西侧，东临塔克拉玛干沙漠，蜱分布十分广泛，璃眼蜱属、扇头蜱属、钝缘蜱属、革蜱属、盲花蜱属等蜱类均有分布，且其中璃眼蜱属和扇头蜱属分布较为优势[16-18]。本次研究选取新疆维吾尔自治区喀什地区巴楚县采用布旗法所采得游离蜱342只，经形态学及16S rDNA鉴定均为亚洲璃眼蜱。该蜱为三宿主蜱，成虫的主要宿主为大中型有蹄类动物如骆驼和羊，小型哺乳动物如啮齿类动物及鸟类则为其中间宿主或机会宿主[19]。亚洲璃眼蜱在新疆乃至中国分布广泛，目前已从该蜱种中检出多种病原体，如新疆出血热病毒(Xinjiang hemorrhagic fever virus)、立克次体、嗜吞噬细胞无形体、查菲埃立克体、伯氏疏螺旋体、巴贝斯虫(Babesiamicroti)等[20]。

伯氏疏螺旋体作为莱姆病的病原体，目前已经于中国23个省(直辖市、自治区)的蜱或宿主动物中分离获得，且不同地区的基因型分布具有明显差异[21]。米氏疏螺旋体在进化上更接近回归热螺旋体(Borreliarecurrentis)，但与伯氏疏螺旋体有着相同的宿主和传播媒介[22]。本次研究通过PCR法检出14只蜱携带伯氏疏螺旋体，包括B.garinii、B.afzelii和B.valaisiana基因型，其中B.garinii和B.afzelii均为致病基因型，B.valaisiana基因型为新疆首次报道，其致病性目前尚未明确。7只蜱携带米氏疏螺旋体，据报道目前我国仅在黑龙江和山西发现米氏疏螺旋体[23-24]，米氏疏螺旋体在新疆喀什地区为首次发现，提示喀什地区应进一步开展对伯氏疏螺旋体和米氏疏螺旋体的媒介、宿主及人群感染情况的调查研究。

无形体属与埃立克体属同属于无形体科，无形体属中嗜吞噬细胞无形体为其主要致病种，可引起人粒细胞无形体病[25]，埃立克体属中查菲埃立克体为其主要致病种，可引起人单核细胞埃立克体病[9]。本次研究中查菲埃立克体在16S rDNA V3-V4区高通量测序及PCR检测中均未检出，嗜吞噬细胞无形体在16S rDNA V3-V4区高通量测序中只能鉴定到属一级水平，缺少进一步数据，而PCR检测检出3只蜱携带该病原体。嗜吞噬细胞无形体因栖息地及贮存宿主不同，在致病性及16S rDNA多样性上均有所差异[12]。对该病原体阳性样本扩增序列进行聚类分析表明，喀什地区嗜吞噬细胞无形体与中国山羊及犬体内病原体具有较高的同源性。

斑点热群立克次体属于立克次体属，可引起人斑点热，常由蜱或螨叮咬传播[26]。结合16S rDNA V3-V4区高通量测序及PCR扩增结果，所有样本均为阴性。据文献报道，弗朗西斯菌属内共生体(Francisella-like endosymbionts)与斑点热群立克次体数量水平成反比，提示弗朗西斯菌属内共生体可能会抑制斑点热群立克次体在蜱体内的定植[27]。本次研究中所有样本均含有高丰度的弗朗西斯菌属内共生体，因此斑点热群立克次体的阴性结果可能与此相关。

16S rDNA V3-V4区高通量测序分析表明，有1个样本含有贝纳柯克斯体，有9个样本含有柯克斯体属(类)内共生体(Coxiella-like endosymbionts),PCR方法扩增 IS1111基因片段检出2只蜱阳性，经BLAST比对与贝纳柯克斯体同源性为99%～100%。贝纳柯克斯体与柯克斯体属内共生体同属于柯克斯体属，贝纳柯克斯体为人类Q热的病原体，而柯克斯体属内共生体在蜱体内多作为维生素供主存在，缺少毒力基因，不存在致病性[28]。Duron等对柯克斯体的全基因组测序表明，贝纳柯克斯体由柯克斯体属内共生体进化而来，由于16S rDNA的高度保守性，16S rDNA测序难以阐明两者间的进化关系[29]。Smith等基于柯克斯体161个直系同源基因的进化分析表明两者为近亲关系，而非进化关系[28]。目前，国内外对柯克斯体属的研究大部分集中于贝纳柯克斯体，而对柯克斯体属内共生体的了解尚不充分，这对今后的研究方向有所提示。

16S rDNA高通量测序具有检测速度快、灵敏度高等优点，目前已广泛应用于蚊、蜱等多种媒介生物的微生物种群研究[30]。该方法能够检出难以培养的菌种，且可以同时对大量菌种进行检测。但其局限性也较为明显。由于二代测序的读长限制，16S rDNA高通量测序通常只能选取1～3个可变区进行检测，分类结果难以覆盖所有菌种，部分菌种只能分辨到属一级水平[27]。某些细菌在属水平下16S rDNA高变区高度保守，导致种水平下难以区分，比如立克次体属，尤其是斑点热群立克次体[31]。而PCR法可以对病原体特异性基因进行检测，有灵敏度高、特异性好等优点。但每次检测菌株种类有限，效率较低。因此，对以上2种检测方法进行综合运用，能够使蜱媒病原生物携带情况的检测结果更加高效、全面、可信。

利益冲突：无