农产品混合样品中农药残留的快速筛选定量检测方法

宋世文 袁娜娜 宋晓仪 张 玲 梁川州 王 瑞

（1.深圳市质量安全检验检测研究院，广东深圳 518101；2.深圳市安鑫宝科技发展有限公司，广东深圳 518101；3.武汉理工大学，武汉 430070）

近年来，我国相关部门因安全监管需要对农产品中的农药残留进行了大量检测，这些检测有3个特点，分别是样本检测数量大、发现农产品农药残留超标率通常在3%以下以及超标率在逐年降低。例如，深圳市2019年对69 065批次食品和农产品进行了检测，其中蔬菜水果抽检数量约为3万批次[1]；广东省农业农村厅2021年对2 234批次蔬菜产品开展监督抽查，农药残留超标率为2.5%[2]；深圳市宝安区2016年抽检种植业产品768批次，农药残留超标率为3.0%，2019年抽检682批次，超标率为1.6%，2021年抽检585批次，超标率为0.85%。由于实际农产品农药残留检测的批次数量大、超标率低，因而需要精确可靠且可高效快速筛选的检测方法。

目前，农产品中农药残留的检测方法主要分两大类，即常规检测方法和快速检测方法。其中，常规检测方法主要是气相或液相色谱法[3]、气相或液相色谱-串联质谱法[4～7]、毛细管电泳法[8～11]，这些方法的特点是通量大、灵敏度高、准确性好，但成本高、检测时间长；快速检测方法包括酶反应法、免疫分析法、生物传感器法、光谱分析法等[12～15]，这些方法普遍存在灵敏度不够、通量不够、专一性不强等不足，因此不适合多组分定量检测。

本文提出的农产品混合样品中农药残留快速筛选定量检测方法，将整合两类方法的优点，即将N（N≤10）个单样品组成一个混合样品，选择有代表性的108种常见农药，利用超高效液相色谱-串联质谱法，研究优化灵敏度、技术操作和质谱参数以满足混合样品检测方法要求，以期为农产品质量安全检测提供工作效率更高的技术方法。

一、方法概述

（一）方法基本定义按一定标准，将样品制备成有代表性单一种类的样品，称其为单样品；将N个单样品等量混合组成1个混合样品；N定义为混合样品包含的单样品个数（N≤10），简称包含数；应用快速筛选定量检测法检测混合样品的农药残留量为初检；初检发现混合样品有疑似阳性，再对单样品检测称为复检。

（二）方法测定过程首先，将单样品等量混合成混合样品。然后，应用快速筛选定量检测法检测混合样品中的农药残留量，例如检测出混合样品中氯氰菊酯含量为0.005 6 mg/kg，需转换成单样品结果进行符合性判定，若每个单样品氯氰菊酯含量≤0.005 6×Nmg/kg，即每个单样品氯氰菊酯含量≤0.056 mg/kg（N＝10）。再应用GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[16]来判定单样品是否疑似阳性，如果疑似阳性，该单样品需要复检，以确认是否超标，若复检单样品超标，则该样品判定为超标；如果没有疑似阳性，则全部N个单样品判定为阴性。

（三）方法检测效率概念及推演

1.检测效率概念。检测效率指一批样品用单样品检测法需要检测的样品数量/混合样品初次检测和复检样品总数量，单样品检测法需要检测的样品数量就是N的和。

2.检测效率推演。如果100个单样品、超标率假定是3.0%，N取10则可以组成10个混合样品。通常方法需要检测100个单样品；而用混合样品检测法，初次检测10个混合样品，因超标率为3.0%，则最多30个单样品疑似阳性，最少是3个单样品疑似阳性，所以需复检最多30个单样品，最少3个单样品，即初检和复检样品总数是13～40个，理论检测效率（超标率3.0%情况下）为2.5（100/40）～7.7（100/13）。以上为理论检测效率计算，方法的具体检测效率还需要实际检测数据验证。

（四）方法必须满足的技术条件方法必须满足的技术条件主要包括4点。（1）为满足监管工作的需要，方法可检测的农药残留对象应包括重要的、常见的、常用的、易被检出的和易检出超标的农药。（2）混合样品检测的灵敏度必须足够高才能满足单样品判定的要求，最关键的是定量限须满足用GB 2763-2021标准来判定单样品的要求。对多数高毒剧毒类农药，定量限应≤1μg/kg；对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，要求比较特别，定量限≤0.7μg/kg；对于其他的农药定量限要求不尽相同，有的≤1μg/kg，有的≤2μg/kg，也有的≤5μg/kg或更高。（3）回收率和精密度等须达到GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[17]要求。基质效应适当，以保障方法有足够的稳定性和准确性。（4）方法须有足够高的检测效率，通常应大于3。

二、材料与方法

（一）主要仪器与设备超高效液相色谱（UPLC-ACQUITY，美国WATERS公司）；三重四极杆串联质谱联用仪（Triple Quad 5500型，美国AB SCIEX公司）；氮吹仪（N-EVAP 112型，美国Organomation Associates公司）；台式高速离心机（K-30K型，德国SIGMA公司）。

（二）农药标准品108种农药标准物质均为1 000 mg/L，由农业农村部环境质量监督检验测试中心提供，纯度≥95%。依据农药标准品的编号（见表1），分为A（编号1～35）、B（编号36～70）和C（编号71～108）3组。每组分别取标准品配制成20 mg/L的混合标准储备液，于-18℃冰箱中保存，有效期为6个月。用A、B、C 3组的混合标准储备液配制成5 mg/L的混合标准工作液，于-18℃冰箱中保存，有效期为1个月。

表1 108种农药化合物的保留时间、离子对质谱参数和定量限

（三）108种农药组分的确定原则选择有代表性、经常使用、易被检出的、易被检出超标的农药，以满足安全监管工作需要。目前，国内利用液相色谱-串联质谱检测农药残留的标准主要有GB 23200.121-2021[6]和GB/T 20769-2008，本方法填补国内检测标准的14项检测项缺失，其中包括常见菊酯类农药10项，分别是氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、生物丙烯菊酯、苯醚菊酯、苯醚氰菊酯、丙烯菊酯、甲醚菊酯、炔咪菊酯、氟丙菊酯；其他常见农药4项，分别是甲基对硫磷、克螨特、百菌清、杀螟硫磷。

（四）单样品及混合样品制备单样品制备：取有代表性的蔬菜、水果、食用菌组成的样品1 kg，先切成小块，用高速组织粉碎机充分粉碎，取300 g，冷冻备用。混合样品制备：将10个上述备用的单样品各取30 g，组成1个混合样品，再用高速组织粉碎机充分混匀，冷冻备用。

（五）混合样品前处理方法称取20.00 g试样于80 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈及1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1 min，加入4 g无水硫酸镁、2 g氯化钠、2 g柠檬酸钠二水合物、1 g柠檬酸二钠盐倍半水合物，再剧烈振荡3 min后在4 500 r/min条件下离心5 min。定量吸取上清液10 mL至内含除水剂和净化材料的塑料离心管中（每毫升提取液使用150 mg无水硫酸镁、25 mgN-丙基乙二胺、25 mg C18粉、5 mg石墨化碳黑），以4 500 r/min离心5min，吸取上清液4 mL，氮吹后至近干，用1mL丙酮-水-甲醇溶液（2∶3∶5，体积比）复溶，过微孔滤膜后待测定。

续表1

续表1

（六）超高效液相色谱-串联质谱条件C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）；流动相A为0.1%甲酸盐水溶液（含5 mmol/L乙酸铵溶液），流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液（含5 mmol/L乙酸铵溶液）。流动相梯度条件为0 min，98%A；0.5 min，98%A；1.0 min，90%A；4.0 min，85%A；4.5 min，60%A；5.5 min，50%A；8.5 min，30%A；9.0 min，5%A；10.0 min，85%A；10.5 min，98%A；12.0 min，98%A。流速为0.3 mL/min；柱温为40℃；进样量为4～6μL。离子源类型为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正离子和负离子同时扫描；电喷雾电压为正离子5 500 V、负离子-4 500 V；离子源温度为600℃；雾化气压力为413.69 kPa；辅助加热气压力为379.21 kPa；气帘气压力为275.79 kPa。优化后的108种农药化合物的离子对质谱参数和定量限见表1。

三、结果与分析

（一）氮吹复溶溶剂的配比氮吹复溶溶剂配比优化试验设计V丙酮∶V水∶V甲醇分别为0∶1∶1（配比A）、1∶4∶5（配比B）、2∶3∶5（配比C）、3∶2∶5（配比D）的4种配比条件，做3次重复，以优化丙酮-水-甲醇溶液的比例。用阴性基质做回收，各农药加标10μg/kg。选择有代表性的7类农药9种组分的数据来考察，结果见表2。由表2得出，在4种配比条件下，苯并咪唑类杀菌剂多菌灵、新烟碱类杀虫剂吡虫啉、氨基甲酸酯类杀虫剂克百威、有机磷类杀虫剂氧乐果和甲拌磷的回收率和精密度均符合GB/T 27404-2008标准的要求，即回收率在60%～120%范围内，变异系数≤32%；在丙酮量低的配比A、配比B条件下，菊酯类杀虫剂甲氰菊酯和氯氰菊酯、大环内酯类杀虫剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的回收率较低，最低达到0%（氯氰菊酯）；在丙酮量相对高的配比C、配比D条件下，全部20种菊酯类农药的回收率分别为69.5%～118.7%和77.0%～118.6%，其他88种组分的回收率分别为61.5%～114.0%和64.2%～118.8%，回收率和精密度都符合GB/T 27404-2008标准要求。配比C和配比D条件下，108种农药化合物的回收率和精密度没有明显差异，因配比C的丙酮量相对较少而水量相对较多，复溶时可能会少溶解一些叶绿素和有机物质，对降低基质效应有利，因此本文最终选择V丙酮∶V水∶V甲醇＝2∶3∶5的配比条件。

表2 氮吹复溶溶剂丙酮-水-甲醇的配比优化试验结果 （%）

（二）方法定量限、线性范围和相关系数在本文条件下，选择叶绿素含量高的混合基质（由甘薯叶、葱、绿辣椒、绿苋菜、菠菜、韭菜、绿甘蓝、香菜、油麦菜、蕹菜10种单一基质组成）、其他色素含量高的混合基质（由黄甜椒、红辣椒、胡萝卜、红甜椒、黑木耳、紫甘蓝、橙、南瓜、番茄、西瓜10种单一基质组成）、色素含量低的混合基质（由大白菜、黄瓜、西葫芦、小白菜、莲藕、白萝卜、冬瓜、香蕉、梨、苹果10种单一基质组成）、食用菌混合基质（由香菇、平菇、草菇、金针菇、杏鲍菇、猴头菇、鸡腿菇、鲜银耳、虫草花、白蘑菇10种单一基质组成）等4种阴性混合基质，取一定量的混合标准溶液，配成0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L的基质标准溶液，以仪器响应峰面积对各农药化合物的质量浓度进行线性回归分析。结果表明，各农药化合物在0～20.0μg/L的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.990。同样取上述4种混合基质添加混合标准溶液0、0.5、1.0、5.0μg/kg，得到108种农药组分的定量限（LOQ，信噪比≥10）在0.5～5.0μg/kg范围内 （见表1)。 经查询GB 2763-2021标准，本方法的定量限均低于标准中各农药最大残留限量（MRLs），满足检测要求。

（三）基质效应

1.混合样品基质效应分析。本方法在氮吹浓缩的同时加大了进样体积以提高灵敏度，但基质效应不可忽视。为此特别设计了基质效应试验，以上述氮吹复溶溶剂为对照，以叶绿素含量高的、色素含量低的、其他色素含量高的混合基质和食用菌混合基质为试验组，参照混合样品操作，添加15 μg/L混合标准溶液，测定108种农药化合物的峰面积，结果见表3。

表3 混合样品基质效应试验结果 （%）

以复溶溶剂中农药化合物的峰面积为100对照分析，结果显示，4种混合基质中108种农药的平均峰面积明显降低，只有对照峰面积的53.0%～74.0%；叶绿素含量高的混合基质的基质效应最大，其次为色素含量低的和其他色素含量高的混合基质，食用菌混合基质最小。以这4种混合基质中108种农药的平均峰面积为100进行分析，结果显示，从平均值看，4种混合基质之间每个农药组分峰面积差异不明显（在±25%范围内）；从变化范围看，在叶绿素含量高的、色素含量低的以及其他色素含量高的混合基质中各农药相对峰面积平衡分布在100%上下（在±25%范围内），但食用菌混合基质中各农药相对峰面积分布在102.1%～129.2%。

具体应用时，须用与样品接近的基质配制标准溶液，这样可以尽可能消除基质效应的影响。如果样品全部是食用菌混合基质，则须用相应的食用菌基质配制标准溶液。除食用菌混合样品外，其他样品的混合基质可以通用来配制标准溶液。

2.混合样品与单样品基质效应的对比分析。除选定上述叶绿素含量高的、色素含量低的、其他色素含量高的混合基质和食用菌混合基质外，增加一个不分色素含量高低的混合基质，添加15μg/L混合标准溶液，测定108种农药化合物的峰面积，结果见表4。以混合基质中108种农药化合物的峰面积为100，不分色素含量高低的10种单一基质中各组分的相对峰面积在48.5%～203.2%之间，说明单样品与混合样品相比，基质效应明显。再观察根据色素含量分类的其他4类基质，108种农药组分的相对峰面积变化范围在平均值的±30%范围内，可见依据色素含量分类的混合样品的基质效应与单样品的基质效应相比较小。实际应用中，按本文依据色素含量分类混合样品是一种可行方案，之后试验可对基质效应作更详细的分析研究，以求方法更方便检测和应用。

表4 混合样品与单样品基质效应比较结果

（四）方法回收率与精密度添加回收试验选择了上述叶绿素含量高的、色素含量低的、其他色素含量高的混合基质和食用菌混合基质4类混合基质。各类基质添加标准溶液在一种单一基质中，添加浓度换算成混合样品中浓度为低浓度0.5～5.0 μg/kg(即定量限）、中浓度10.0μg/kg、高浓度20.0μg/kg。每个基质做6次重复，每次重复在不同的单样品基质添加标准溶液（见表5）。

由表5可见，4种混合基质中，低浓度加标水平下108种农药的回收率在60%～120%范围内，中浓度和高浓度加标水平下回收率在80%～110%范围内，符合或优于GB 27404-2008标准对检测方法回收率的要求；低浓度加标水平下变异系数≤20%，中浓度和高浓度加标水平下变异系数＜11%，也完全符合GB 27404-2008标准对检测方法精密度的要求。

表5 方法回收率和精密度试验结果

四、结论

本文提出了基于超高效液相色谱-串联质谱的农产品混合样品中108种农药残留快速筛选定量检测方法，推荐依据色素含量分类混合样品。通过对氮吹复溶溶剂的配比优化和方法学考察，得到选定V丙酮∶V水∶V甲醇＝2∶3∶5为配比条件时，各组分有较好的回收率；108种农药化合物的定量限在0.5～5.0μg/kg之间，全部低于GB 2763-2021标准规定的各农药最大残留限量，符合检测要求；方法的线性范围为0～20.0μg/L，相关系数大于0.990；低浓度0.5～5.0μg/kg加标水平下108种农药化合物的回收率在60%～120%范围内，中浓度10.0μg/kg、高浓度20.0μg/kg加标水平下其回收率在80%～110%范围内，低浓度和中高浓度加标水平下变异系数分别≤20%和＜11%，上述指标完全符合通用标准GB/T 27404-2008对检测方法的要求。本方法可以满足混合样品中多种农药残留的实际检测工作需要。