授粉受精关键生物学因素对兔眼蓝莓自花授粉坐果率的影响

杨芩， 付燕， 宋宇， 徐未琳， 彭舒， 邓洁

(1.凯里学院 大健康学院，贵州 凯里 556000； 2.黔东南民族职业技术学院，贵州 凯里 556000)

蓝莓为杜鹃花科越橘属落叶或常绿灌木[1-2]，其果实不仅含有糖、类胡萝卜素、香精油、维生素和矿物质等营养物质，而且富含多酚或生物活性物质，如花青素、黄烷醇和黄酮醇等黄酮类化合物[3]。临床证据表明，充分摄入蓝莓有降低血压，预防心脏病发作，预防癌症，改善心理健康和控制糖尿病等多种健康益处[4]。因此，近20年来，我国蓝莓产业发展迅速，截至2020年底，全国蓝莓栽培面积6.64万hm2，总产量34.72万t，鲜果产量23.47万t[5]，矮丛蓝莓、高丛蓝莓和兔眼蓝莓是目前栽培的三大栽培类型[6]。长久以来，国内外学者熟知，蓝莓栽培中需多品种搭配栽培，以克服蓝莓自花授粉结实率低、难以保证产量的问题[7-15]。

具有活力的花粉通过媒介落在柱头表面，然后在柱头上天然培养基黏液的作用下水合萌发，并沿着花柱中的花粉管生长通道生长进入胚囊并完成双受精，受精是果树能够正常结实的必要条件[16-17]。坐果率的高低与花粉活力直接相关，例如扁桃[18]、澳洲坚果[19]坐果率低的原因之一是花粉活力低。柱头接受花粉的能力是柱头与花粉黏附和水合萌发的生理基础[20]，坐果率高低与可授性的强弱和强可授性持续时间有着密切联系[21-23]。同时，花粉在柱头上萌发后花粉管生长穿过花柱，随之进入胚囊最后完成精核与卵核融合过程的亲和性对坐果也有着至关重要的影响[13,16,24]。当然，精核与卵核融合时，胚囊是否具有活力是决定能否坐果的必要条件[16-17,25]。因此，花粉活力、柱头可授性、授粉亲和性和胚囊寿命被认为是影响果树授粉受精的关键生物学因素[26]。

因此，蓝莓的授粉受精生物学特性一直备受学者关注和重视，不同蓝莓品种的花粉活力差异大，同一品种不同发育时期的花粉活力亦存在着显著差异[27]。不同蓝莓品种的柱头可授性有着显著差异，柱头拥有强可授性的时期不一致，维持强可授性的时间亦不一致[28-30]。自花授粉和异花授粉对花粉管生长速度和亲和性有显著影响[13,30]，自花授粉能加速胚囊退化使果实中的种子数量减少，同时种子变小[13,31]。同时，蓝莓的花粉活力、柱头可授性、花粉管生长速度亦受温度和降雨等环境因素影响，进而影响坐果[3,32]。然而，遗憾的是这些研究报道大多仅关注花粉活力、柱头可授性、花粉管生长速度和胚囊活力中的某一方面，或者参试的材料较少，缺乏系统的研究，研究结果较为局限。因此，关于蓝莓自花授粉结实率低的关键生物学因素是花粉活力？还是柱头可授性？或者是授粉亲和性？或者是胚囊寿命？或兼而有之？迄今为止仍扑朔迷离。

因此，本研究以目前主栽的6个兔眼蓝莓品种为试材，对不同花龄的花粉活力和柱头可授性进行测定，同时在此基础上开展花粉活力和柱头可授性对自花授粉亲和性及坐果率的影响，并在此基础上开展各参试品种自花授粉坐果率与花粉活力、柱头可授性、授粉亲和性、胚囊寿命的相关性分析，以期探明参试品种自交坐果率低的关键生物学因子，为阐明蓝莓自花授粉结实率低提供基础资料，同时对指导生产实践亦具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

以种植于“凯里学院校内卓越农林人才培养实训基地”内生长健壮的、生长状况一致且无病虫害的8年生的灿烂(VacciniumasheiBrightwell)、杰兔(VacciniumasheiPremier)、粉蓝(VacciniumasheiPowderblue)、巴尔德温(VacciniumasheiBaldwin)、顶峰(VacciniumasheiClimax)、园蓝(VacciniumasheiGardenblue)6个兔眼蓝莓品种为研究对象。

1.2 方法

1.2.1 花龄对花粉活力的影响

于各参试品种的盛花始期，按照本实验室的方法[1,12,21]收集各品种开花第0～7天的花粉及测定花粉活力。

1.2.2 花粉活力对自花授粉坐果率的影响

于各参试品种的盛花始期，按照本试验的方法[1,12,21]每个品种选择2 400朵大蕾期花去雄，于去雄后第3天收集各品种开花第0～7天的花粉进行自花授粉，授粉后第30天统计坐果率，每个处理300朵花，每100朵花为1次重复，每处理重复3次。

1.2.3 花龄对柱头可授性的影响

于各参试品种的盛花始期，按照本实验室的方法[1,12,21,28]收集各品种开花第0～7天的花柱及测定柱头可授性。

1.2.4 柱头可授性对自花授粉坐果率的影响

于各参试品种的盛花始期，按照本试验的方法[1,12,21,28]每个品种选择2 400朵大蕾期花去雄，分别于去雄后第0～7天采用各品种开花第3天的花粉进行自花授粉，授粉后第30天统计坐果率，每处理300朵花，每100朵花为1次重复，每处理重复3次。

1.2.5 自花授粉花粉管动力学观察

于各参试品种的盛花始期，按照本试验的方法[12-13,21]每个品种选择480朵大蕾期花去雄，分别于去雄后第0～7天，采用各品种开花第3天的花粉进行自花授粉，授粉后第96小时采集各处理的花利用荧光显微镜观察，统计花柱基部被花粉管生长穿过的比率及胚囊退化率，每个处理60朵花，每20朵花为1次重复，每处理重复3次。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 22.0对试验数据在5%显著水平进行SNK分析。同时开展坐果率与花龄、花粉活力、拥有不同强度柱头可授性的花柱比率、被花粉管生长穿过的花柱比率、胚囊退化率的相关性分析，以阐明参试品种自花授粉结实率低的关键生物学因素。

2 结果与分析

2.1 花龄对花粉活力的影响

由表1可知，花龄对参试品种的花粉活力有着显著的影响，总体上表现为花粉活力先增加后下降的趋势。在大蕾期，参试品种间的花粉活力存在显著差异，粉蓝的花粉活力最高为84.26%，其余花粉活力从高到低依次为灿烂、巴尔德温、园蓝、顶峰和杰兔，分别为79.20%、63.94%、51.64%、46.09%和31.66%。各参试品种花粉活力达到最高值的花龄不一致，且各参试品种的最高花粉活力存在显著差异；杰兔的最高花粉活力为开花第3天的50.67%；粉蓝在开花第1～3天的花粉活力达到高峰期，为90.85%～92.96%，且显著高于其他花龄的花粉活力；顶峰的最高花粉活力为开花第2天的92.28%，开花第1和第3天的花粉活力分别为83.05%和85.71%；灿烂的花粉活力高峰期与粉蓝的一致为开花第1～3天，花粉活力85.72%～87.77%；巴尔德温的最高花粉活力为开花第2天的83.66%，开花第1和第3天的花粉活力分别为74.11%和76.59%；园蓝的最高花粉活力为开花第4天的82.73%，开花第1～3天的花粉活力分别为72.65%、75.03%和77.75%。在开花第4天各参试品种的花粉活力虽然均显著下降，但除了杰兔外，其余的5个品种在开花第4～6天的花粉活力仍可达到48%以上。在开花第7天，粉蓝、顶峰、灿烂、巴尔德温和园蓝的花粉活力分别显著降低为32.56%、28.69%、31.38%、28.97%和27.56%，且这5个品种在开花第7天的花粉活力无显著差异，但杰兔开花第7天的花粉活力仅为20.59%，且显著低于其他5个品种开花第7天的花粉活力。

表1 花龄对兔眼蓝莓花粉活力的影响

2.2 不同花龄的花粉对自花授粉坐果率的影响

表2表明，用不同花龄的花粉对参试的6个兔眼蓝莓品种开花第3天的花进行自花授粉，获得的坐果率在不同品种间相同花龄的花粉和同一品种内不同花龄的花粉间虽然有一定的显著性差异，但坐果率均未超过30%，仅为21.33%～28.00%。利用开花第0～7天的花粉进行自花授粉后，在相同花龄的花粉情况下，巴尔德温的坐果率均最高，为26.00%～28.00%，开花第0～1天巴尔德温的坐果率显著高于其他5个品种。杰兔、粉蓝、顶峰、灿烂和园蓝不同花龄的花粉自花授粉后坐果率分别为22.67%～26.33%、23.33%～26.33%、21.33%～24.00%、22.00%～23.67%和23.67%～26.00%。

表2 不同花龄的花粉对自花授粉坐果率的影响

2.3 花龄对柱头可授性的影响

由表3可知，参试的品种间的柱头可授性强度的变化趋势相似，从大蕾期至开花第7天，6个参试品种的柱头可授性由弱逐渐增强到第3天达到最强，然后随着发育期的延长逐渐减弱至不具有可授性。其中，杰兔在开花当天就有较强可授性，而其他5个品种在开花当天具有弱可授性；灿烂和巴尔德温在开花第1天的柱头可授性强度高于其余4个品种同发育期的柱头可授性；园蓝开花第3天的柱头可授性强度低于其余5个品种同发育期的柱头可授性；灿烂和巴尔德温开花第4天的柱头可授性强度高于其余4个品种相同发育期的柱头可授性；杰兔、顶峰和粉蓝在开花第5天的柱头可授性强度低于其他3个品种同时期的柱头可授性。6个参试品种的柱头可授性均持续6 d左右，但灿烂和巴尔德温2个品种在开花第1～5天均具有较强或强的柱头可授性，其他4个品种具有较强或强柱头可授性的时期主要集中在开花第2～3天。

表3 花龄对柱头可授性强度的影响

2.4 不同花龄的花柱对自花授粉坐果率的影响

由表4可知，利用开花第3天的花粉对6 个参试品种不同花龄的花自花授粉后，在同一品种内，随花龄的不断延长，自花授粉坐果率表现为先降低后略有增加再逐渐显著降低的趋势。各参试品种均在大蕾期获得自花授粉品种内最高的坐果率，杰兔、粉蓝、顶峰、灿烂、巴尔德温和园蓝的坐果率分别为54.67%、53.33%、40.33%、45.67%、67.67%和55.00%；在开花第6天，6个参试品种的自花授粉坐果率均下降至20.00%以下；至开花第7天，自花授粉坐果率仅为1.00%～6.33%。值得关注的是，在6个参试品种具有强可授性的开花第2～3天自花授粉的坐果率均显著低于具有适中或弱可授性的开花第0和第1天的坐果率；同时，除了粉蓝和园蓝以外，其他4个品种开花第4天的坐果率均高于开花第3天的坐果率。

表4 不同花龄的花柱对自花授粉坐果率的影响

2.5 花龄对自花授粉亲和性的影响

由表5可知，花龄对被花粉管生长穿过的花柱比率有着显著影响，总体变化趋势与花龄对自花授粉坐果率的影响一致，表现为被花粉管生长穿过的花柱比率先显著降低后略有增加再显著降低。在开花第0天，杰兔、粉蓝、顶峰、灿烂、巴尔德温和园蓝自花授粉后被花粉管生长穿过的花柱比率分别为68.33%、66.67%、51.67%、61.67%、83.33%和70.00%；在开花第5天，除了巴尔德温外，其余5个品种自花授粉后被花粉管生长穿过的花柱比率均未超过20.00%；至开花第7天，被花粉管生长穿过的花柱比率仅为3.33%～6.67%。值得关注的是，在6个参试品种具有强可授性的开花第3天利用各自开花第3天的花粉进行自花授粉后，被花粉管生长穿过的花柱比率均显著低于具有适中或弱可授性的开花第0和第1天的被花粉管生长穿过的花柱比率；同时，除了粉蓝以外，其他品种开花第4天的被花粉管生长穿过的花柱比率均高于开花第3天的被花粉管生长穿过的花柱比率。

表5 花龄对被花粉管生长穿过的花柱比率的影响

2.6 花龄对胚囊退化的影响

表6表明，花龄对参试品种的胚囊退化有着显著影响，总体上表现为随花的逐渐发育胚囊退化率逐渐增加。在开花第0天，杰兔胚囊的退化率为67.33%，显著高于其他5个品种，巴尔德温和园蓝胚囊的退化率分别为47.33%和42.00%，显著高于粉蓝(33.33%)、顶峰(38.67%)和灿烂(36.67%)。开花第1天后，参试6个品种的胚囊退化率均显著增加，在柱头可授性最强的开花第3天，杰兔、粉蓝、顶峰、灿烂、巴尔德温和园蓝的胚囊退化率分别为83.33%、76.00%、68.67%、65.33%、62.67%和75.33%，6个品种的胚囊退化率均超过60.00%，且杰兔的胚囊退化率显著高于其他5个品种；在开花第4天，参试6个品种的胚囊退化率均超过70.00%；在开花第7天，参试的6个品种的胚囊退化率均超过90.00%，且此时品种间的胚囊退化率无显著性差异。

表6 花龄对胚囊退化率的影响

2.7 自花授粉坐果率与授粉受精关键生物学因素的相关性分析

表7表明，参试的6个兔眼蓝莓品种，除了园蓝以外，其余5个品种的自花授粉坐果率均与花粉活力不存在显著相关性。参试6个兔眼蓝莓品种自花授粉的坐果率与可授性强度的相关性则相较复杂，坐果率与拥有不同强度可授性的花柱的比率相关显著性不一致。杰兔、顶峰、巴尔德温和园蓝4个品种的自花授粉坐果率与具有强可授性的花柱比率不存在显著相关性，粉蓝和灿烂自花授粉的坐果率与具有强可授性的花柱比率显著相关；粉蓝、顶峰和灿烂3个品种自花授粉坐果率与具有较强可授性的花柱比率存在显著正相关，巴尔德温自花授粉坐果率与具有较强可授性的花柱比率存在极显著正相关，杰兔和园蓝自花授粉的坐果率与具有较强可授性的花柱比率不存在显著相关性；粉蓝、顶峰和园蓝自花授粉坐果率与具有弱可授性的花柱比率存在极显著正相关，灿烂和巴尔德温自花授粉坐果率与具有弱可授性的花柱比率存在正相关，杰兔自花授粉坐果率与具有弱可授性的花柱比率不存在显著相关性；参试6个品种自花授粉的坐果率与不具有可授性的花柱比率存在极显著负相关关系。参试6个兔眼蓝莓品种自花授粉的坐果率均与被花粉管生长穿过的花柱比率极显著正相关，相关系数分别为0.965、0.967、0.947、0.966、0.960和0.962；与胚囊退化率呈极显著负相关，相关系数分别为-0.926、-0.969、-0.878、-0.937、-0.848和-0.964。

表7 坐果率与授粉受精关键生物学因素的相关性分析

3 讨论

果树生产栽培以果实为收获对象，因此，能够顺利地完成授粉受精对于绝大多数果树生产栽培来说具有极其重要的现实意义，而坐果率的高低对于小浆果蓝莓的高产栽培有着决定性的作用。目前主栽的南高丛蓝莓、北高丛蓝莓和兔眼蓝莓均为多倍体[33]，一般而言多倍体减数分裂过程易出现异常而致花粉和胚囊活力降低[25]。然而，本研究发现，参试的6个兔眼蓝莓品种，除了杰兔之外，其他5个品种的花粉活力最高值均超过80.00%，这可能归因于参试品种均为六倍体[33]，属偶数多倍体，在减数分裂时有效地降低了分裂配对异常的概率。前人关于花粉活力对扁桃[18]和澳洲坚果[19]等果树的研究表明，花粉活力的高低对坐果率有着直接的影响，但本研究发现，参试的6个品种，除了园蓝以外，其余5个品种自花授粉的坐果率与花粉活力无显著的相关性，这可能归因于参试品种的自交不亲和性降低了花粉活力对自花授粉坐果率的影响。

本研究发现，花龄对参试6个品种的自花授粉坐果率有着极显著的负相关影响，这主要体现在柱头可授性、授粉亲和性和胚囊寿命3项评价参数方面。柱头作为雌性器官接收花粉的载体，可授性强弱是衡量雌性器官接收花粉并助力花粉萌发能力强弱的直接体现，柱头可授性强度不论对自交还是异交的结实率都会产生重要的影响[34]，本研究发现花龄对参试6个品种柱头可授性强弱的影响与本实验室已有研究结果基本一致[21]。相关性分析表明，参试6个品种自花授粉的坐果率与拥有不同强度可授性的花柱比率有着多样性的相关性，呈现出一定的品种特异性。杰兔自花授粉坐果率与不具有可授性的花柱比率呈极显著负相关关系，与拥有强可授性、较强可授性和弱可授性的花柱比率不存在显著相关性。粉蓝和灿烂自花授粉坐果率与拥有强可授性和较强可授性的花柱比率呈显著正相关，巴尔德温自花授粉坐果率与拥有较强可授性的花柱比率呈极显著正相关。粉蓝、顶峰和园蓝自花授粉坐果率与拥有弱可授性的花柱比率呈极显著正相关，灿烂和巴尔德温自花授粉坐果率与拥有弱可授性的花柱比率呈显著正相关。参试的6个品种自花授粉坐果率与不具有可授性的花柱比率呈极显著负相关，这表明柱头可授性强弱对参试6个品种自花授粉坐果率影响不大，但柱头是否具有可授性对参试品种自花授粉坐果率有着至关重要的影响。这可能归因于蓝莓单朵花的花期较长，且其湿性柱头的表面宽，乳突细胞多，不仅接收花粉的面积大，而且接收和附着能力强[21,28-30,32]。

本研究发现，花龄对参试的6个品种自花授粉后被花粉管生长穿过的花柱比率差异显著。开花第0天进行自花授粉处理获得的坐果率显著高于其他时间进行自花授粉获得的坐果率，同时开花第3天进行自花授粉获得的坐果率显著低于开花第0～2天进行自花授粉获得的坐果率，这可能归因于蓝莓的花柱中存在着某种与S-RNase具有相似作用的物质，且亦具有时空和组织表达的特异性，在开花第3天的花柱中其表达量达到高峰，因而使坐果率显著降低[12]。此外，坐果率的高低在很大程度上取决于雄配子到达目标胚囊时胚囊是否具有活力[17]。已有研究表明，蓝莓授粉后需要48～72 h花粉管能够穿过花柱进入胚囊授粉[13,30]，本研究在开花第0天对各参试品种进行自花授粉，在花粉管进入胚囊后的授粉后第96小时取样观察发现，粉蓝、顶峰和灿烂的胚囊退化率超过30.00%，巴尔德温和园蓝的胚囊退化率超过40.00%，而杰兔的胚囊退化率达到67.33%；同时杰兔开花第3天自花授粉处理的胚囊退化率超过80.00%，其余5个品种的胚囊退化率均超过60.00%。相关性分析表明，各参试品种自花授粉的坐果率与胚囊退化率均呈极显著负相关关系，这表明胚囊的高退化率是各品种自花授粉坐果率低的重要原因之一。

综上所述，柱头是否具有可授性、被花粉管生长穿过的花柱比率和胚囊退化率是参试6个兔眼蓝莓品种自花授粉的坐果率低的关键生物学因素，研究结果为探明兔眼蓝莓自花授粉坐果率低的生物学原理奠定了一定的理论依据。但是，基于自交不亲和性的花粉管生长和胚囊退化是一个错综复杂的生命过程，目前关于蓝莓自交不亲和性和胚囊退化的研究主要集中在表型结果及其应用上，而关于自交不亲和性与胚囊退化的机理研究尚未开展。因此，以花粉管生长过程为线索，利用现代分子生物学技术研究蓝莓花粉管生长和胚囊退化过程中基因表达的差异变化，这应成为今后关于蓝莓自交不亲和性和胚囊退化的分子机制研究的重点。