不同病理类型阑尾炎儿童患者的肠道菌群多样性分析

刘园园 努尔买买提 王亚勇 周京涛

1新疆医科大学第七附属医院（乌鲁木齐 830028）；2新疆医科大学第二附属医院（乌鲁木齐 830028）

阑尾炎发生是由阑尾管腔阻塞、细菌入侵、阑尾畸形等因素综合造成的，可发生在任何年龄。根据临床过程可分为4 种病理类型：急性单纯性阑尾炎、急性化脓性阑尾炎、坏疽性及穿孔性阑尾炎、阑尾周围脓肿［1］。主要病因是由病原菌感染、淋巴滤泡过度增生及阑尾腔内粪石造成的梗阻而产生的炎症。有研究［2］表明急性阑尾炎发病首要因素为病原菌感染，厌氧菌多样性的增加和芽孢杆菌、核芽孢杆菌和疣状芽孢杆菌的易位与急性阑尾炎的进展有关。认识感染灶部位的菌群多样性就显得尤为重要。目前临床多采用阑尾腔内分泌物进行细菌培养及药敏试验来指导临床抗菌药物的合理使用。但是传统培养方法难以模拟菌群自然生长条件，检出率低且严重低估了感染性疾病病原菌的种类和数量，病原学资料是否全面地反映了感染灶菌群情况值得进一步探讨，因其结果会影响到感染性疾病病原菌的诊断和治疗方案的制定［3-4］。本研究采用16S rRNA 基因测序测定儿童急性阑尾炎手术患者阑尾腔分泌物，通过对儿童阑尾炎患者不同病理类型阑尾内容物菌群的多样性分析，为阑尾炎发病机制的组织病原学研究提供新的思路，为临床制定个性化治疗提供理论支持，从而达到避免抗菌药物不合理使用引发菌群失调的目的。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2020年6-12月期间收治的阑尾炎儿童患者12 例，其中男3 例，女9 例。年龄5 ～16 岁，中位年龄11.5 岁。12 例患者中有5 例少数民族患者。手术组织病理证实为单纯性阑尾炎6 例和化脓性阑尾炎6 例。入选标准：（1）阑尾炎经组织病理学检查确诊，均为儿童患者；（2）术前均使用头孢西丁钠一组抗感染治疗；（3）无其他肠道疾病。排除标准：（1）术前使用不同种抗菌药物治疗患者；（2）合并其他疾病者；（3）资料不全者。本研究通过本院伦理委员会关于开展临床研究审批（审批号：20221101-LW01），就整个实验流程各项细节及以后的数据公布等事宜征得志愿者监护人同意，并签署知情同意书。

1.2 方法 由外科医生手术切除阑尾，在无菌环境下用生理盐水擦拭表面渗出物，清洗切口。沿纵轴解剖阑尾组织，用无菌棉签擦拭收集阑尾腔内的所有内容物，并置于无菌收集管中。收集完毕后迅速放入无菌冰盒，转运至-80 ℃冰箱中，备后续分析。

1.2.1 内容物DNA 提取 使用MN NucleoSpin 96 SoiDNA 提取试剂盒提取患者阑尾腔内容物微生物组全基因组DNA 提取，并测定DNA 的数量和质量。

1.2.2 PCR 扩增 16S rRNA 基因 测 序V3-V4 高变区扩增，上游引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和下游引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。Solexa PCR（20 μL 体系）：目的区域PCR 纯化产物5 μL，上、下游引物各2.5 μL，高保真酶10 μL。PCR 反应条件：98 ℃30 s；98 ℃10 s，65 ℃30 s，72 ℃30 s，共10个循环；72 ℃5 min。定量后使用Illumina Novaseq 6000 平台测序。在相似性97%的水平上对序列进行聚类，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU。对可执行OTUs 聚类进行菌群丰度、构成、群落结构、多样性等分析，测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息学分析 序列数据分析应用QIIME2 和R 语言包。应用QIIME2 计算OTUs 水平Alpha 多样性指数，比较样本间的OTU 丰度和均匀度。通过R 语言中的vegan 包对不同样本的微生物群落结构进行Beta 多样性分析，使用python绘图。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，针对细菌丰度的比较，采用Kruskal-Wallis检验进行统计分析，P<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本病原学检查 手术组织病理证实为单纯性阑尾炎6 例和化脓性阑尾炎6 例，均在术中取阑尾内容物进行病原学检查，包括需氧菌培养和厌氧菌培养。单纯性阑尾炎组仅有2 例培养出具体病原菌，1 例为大肠埃希菌，1 例为肺炎克雷伯菌；化脓性阑尾炎组培养出2 例大肠埃希菌。12 例样本仅检出4 例，检出率为33.33%。

2.2 样本测序数据 下机数据tags、有效数据及OTUs 满足测试要求，使用Usearch 软件在97.0%的相似度水平下进行聚类，共获得816 个OTUs，其中单纯性阑尾炎组808 个，化脓性阑尾炎组659 个，两组共有的OTUs 641 个，单纯性阑尾炎特有的OTUs 有167 个，化脓性阑尾炎特有的OTUs 有18 个。

2.3 Alpha 多样性分析 单纯性阑尾炎组与化脓性阑尾炎组的Chao1、Shannon、Simpson 指数比较，单纯性阑尾炎组Chao1、Shannon、Simpson 指数分别为（608.67±95.49）、（5.92±0.76）、（0.95±0.02），化脓性阑尾炎组分别为（475.82±45.19）、（4.16±0.67）、（0.88±0.05），两组差异有统计学意义（P<0.05），表明两组在物种丰度和物种多样性上存在差异（图1）。

图1 Alpha 多样性分析Fig.1 Alpha diversity analysis

2.4 Beta 多样性分析 采用PERMANOVA/Anosim分析对样本进行Beta 多样性分析，Beta 距离越大表示分组差异越大，R 值越接近1 表示组间差异越大于组内差异，P ＜0.05 时说明检验的可信度高；两组样本测得R=0.344，P=0.02，样本间差异明显，组间差异大于组内差异，且差异有统计学意义（图2）。

图2 PERMANOVA/Anosim 分析Fig.2 PERMANOVA/Anosim analysis

2.5 组间菌群结构差异性分析 从分析进化图可看出两组阑尾炎患者的阑尾组织内容物在门、纲水平无明显差异，在目、科、属、种水平存在统计学差异（图3）。在科水平Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Ruminococcaceae（瘤胃菌科）、Fusobacteriaceae（梭杆菌科）三个存在差异，单纯性阑尾炎组Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 居多，化脓性阑尾炎组Fusobacteriaceae 居多。两组在需氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌的构成上存在统计学差异，具有各自独立的科。需氧菌中单纯性阑尾炎组具有Lactobacillaceae（乳杆菌科），而化脓性阑尾炎组具有Alcaligenaceae（产碱杆菌科）和Campylobacteraceae（弯曲菌科螺杆菌科）。厌氧菌的构成上，化脓性阑尾炎具有Fusobacteriaceae、Peptostreptococcaceae（消化链球菌科）、Porphyromonadaceae（紫单胞菌科）、Veillonellaceae（韦荣氏球菌科）、Tissierellaceae（组织菌科）。兼性厌氧菌的构成上，单纯性阑尾炎具有Pasteurellaceae（巴斯德氏菌科）、Streptococcaceae（链球菌科），见图4。在属水平Faecalibacterium（粪杆菌属）、Agathobacter（直肠真杆菌属）、Bilophila（嗜胆菌属）三个存在显著性差异，单纯性阑尾炎组Faecalibacterium、Agathobacter居多，化脓性阑尾炎组Bilophila 居多。两组在需氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌的构成上存在统计学差异，具有各自独立的属。需氧菌中单纯性阑尾炎组具有Lactobacillus（乳酸杆菌属），而化脓性阑尾炎组具有Campylobacter（弯曲杆菌属）和Sutterella（萨特氏菌属）。厌氧菌的构成上，单纯性阑尾炎具有Ruminococcaceae、Blautia（布劳特氏菌属）、Faecalibacte-rium，化脓性阑尾炎具有Fusobacterium、Parvimonas（微单胞菌属）、Peptostreptococcus（消化链球菌属）、Porphyromonas（卟啉菌属）、Ruminococcus（瘤胃球菌属）。兼性厌氧菌的构成上，单纯性阑尾炎具有Klebsiella（克雷伯菌属），化脓性阑尾炎具有Bulleidia（布雷德菌属）、Streptococcus（链球菌属），图5。

图3 LEfSe 分析进化分枝图Fig.3 LEfSe analysis diagram of the structural difference

图4 科水平组间差异Fig.4 Differences between groups at the family level

图5 属水平组间差异Fig.5 Differences between groups at the genus level

3 讨论

儿童急性阑尾炎约占小儿外科急性腹痛的20%～30%，临床上多认为其病因为粪便残渣或淋巴组织增生阻塞阑尾管腔，导致管腔内高压力，损害黏膜的完整性，进而导致感染并最终发生急性阑尾炎［5-6］。随着分子生物学技术的发展，一些使用这些技术在阑尾炎领域的研究认为阑尾炎的发生与原发性感染相关［7-9］。高通量测序技术目前已广泛用于肠道微生态研究，其中16S rRNA 测序方法可通过提取样本中编码细菌16S 核糖体基因的核酸序列，根据特定引物扩增该基因可变区序列，然后根据测序和数据库比对进而了解样本中细菌种类、丰度、差异性和多样性［9］。这就弥补了传统病原学培养低检出率的不足，对探讨阑尾炎的发病机制以及个性化治疗具有指导意义［10-12］。

本研究采用16S rRNA 基因测序测定儿童急性阑尾炎手术患者阑尾腔分泌物，结果显示，在属水平菌落组成占总菌落50%的菌群中，发现单纯性阑尾炎阑尾内容物中菌属主要有Bacteroides（拟杆菌属）、Faecalibacterium、Prevotella（普雷沃菌属）、Agathobacter、Akkermansia（艾克曼菌属）、Fusobacterium、Comamonas（单胞菌属）、Parabacteroides（副拟杆菌属）。化脓性阑尾炎内容物中菌属主要有Fusobacterium、Bacteroides、Porphyromonas（卟啉 菌属）、Escherichia_Shigella（埃希菌属-志贺菌属），两组优势菌群均为G-厌氧菌，单纯性阑尾炎组的阑尾内容物中益生菌比例高，而化脓性阑尾炎组中条件致病菌比例更高。THE 等［13］在对儿童阑尾标本的研究中发现，阑尾炎患者的阑尾组织中Fuso-bacteriaceae的丰度增加，它的增加也与阑尾炎的严重程度有关。本研究标本采集自阑尾内容物，得出的结论与其一致，在化脓性阑尾炎组Fusobacteriaceae丰度更高，Faecalibacterium、Agathobacter在单纯性阑尾炎组具有更高的丰度，且差异有统计学意义。Faecalibacterium、Agathobacter这两类菌属可通过产生短链脂肪酸保护肠道黏膜屏障，Faecalibacterium中的普拉梭菌是具有抗炎作用的下一代益生菌［14-16］。厌氧菌组中单纯性阑尾炎患者具有高丰度的Blautia，该菌同样具有产生短链脂肪酸的能力，起到保护肠道黏膜降低人体炎症水平的作用［17］。这些细菌丰度的差异或可用来解释单纯性阑尾炎患者感染指标改变不明显以及镜下病理局限于黏膜或黏膜下层的原因。Bilophila 在化脓性阑尾炎组存在显著差异，该菌目前被认为与肠道屏障更高的渗透性和对感染和结肠癌更高的易感性相关，在阑尾炎中可作为病原菌［18-19］。这与化脓性阑尾炎患者感染指标明显的升高以及镜下炎性病变向肌层及浆膜层扩延的表现呈现一致性。Faecalibacterium、Agathobacter、Bilophila在两组别间的差异有统计学意义，提示该细菌在不同病理类型的阑尾炎中可能存在特殊的临床意义，为阑尾炎的发病机制研究增加理论支持。有益菌丰度减少可能会导致患者肠道正常生理功能受损，这提示肠道微生态制剂或粪菌移植或许对阑尾炎的治疗有所帮助，为保守治疗阑尾炎提供个体化治疗的新的方向。

日常病原学培养检出率高的大肠埃希菌是肠杆菌科埃希菌属细菌，属兼性厌氧菌［20-21］。通过测序发现，埃希菌属在单纯性阑尾炎组丰度为（0.02±0.02），化脓性阑尾炎组为（0.08±0.12），差异无统计学意义（P=0.42），且在菌群构成比例中排名第九位，不是阑尾内容物中的优势菌群。Bacteroides 在两组样本中均有较高丰度，虽差异无统计学意义（P=0.82），但单纯性阑尾炎组（0.15±0.05）的丰度高于化脓性阑尾炎组（0.12±0.05）。刘枘岢等［22］的研究发现2 型糖尿病患者肠道菌群中Bacteroides 的丰度显著下降。朱万英等［23］发现肥胖儿童群体肠道中Bacteroides的多样性及相似性降低。由此可见，Bacteroides参与人体肠道中许多重要的代谢活动，其丰度的平衡对人体健康有着重要的意义。有研究［24］表明抗感染药物对肠道菌群的多样性、结构组成和代谢功能等产生影响。在抗菌药物的抗性基因传播中，参与水平转移的菌种以Bacteroides为主［25］。本研究发现化脓性阑尾炎组Bacteroides丰度降低，而临床阑尾炎抗感染治疗方案常规覆盖厌氧菌，这可能加剧Bacteroides丰度的下降，提示在阑尾炎抗感染治疗中常规覆盖厌氧菌的方案是否必要值得思考。对于保守治疗阑尾炎的患者，Bacteroides对抗菌药物抗性基因的传播也需更加关注。

本研究为单中心研究，存在以下不足：（1）例数较少，患者性别、民族、饮食结构和生活习惯均可造成菌群差异。（2）缺少正常阑尾内容物作对照。后期将增加样本量，并纳入健康对照人群，通过对比正常阑尾内容物，进一步探索阑尾内容物菌群的构成差异。（3）在本研究中，不能回答阑尾炎中粪体的存在和微生物群之间的潜在相关性，这是未来研究的关注点。（4）本研究的一个局限性是使用了预防性抗生素。抗生素的有益作用已被广泛接受，由于它们只在手术前很短的时间内使用，认为抗生素的使用并不能解释研究发现的差异。（5）目前临床治疗方案常规覆盖抗厌氧菌活性，阑尾炎中Bacteroides低丰度的表达，对目前的治疗方案提出了挑战，后期针对不同类型抗菌药物对肠道菌群的影响展开深入研究，为从调整菌群平衡的角度开展阑尾炎的治疗提供支持，从而达到个体化治疗的目的。