清肝凉血解毒汤通过调控JAK2/STAT3信号通路减轻肝细胞损伤研究

张 浩，胡佩佩，王智兰

(南京中医药大学南通附属医院，江苏 南通 226000)

肝脏是重要的免疫器官，能够储存能量，解除毒素，是脓毒症易受损的器官之一[1]。脓毒症肝损伤(Sepsis-associated liver injury,SALI)多由缺血缺氧性损伤，胆汁淤积及过度炎症引发[2]。中医药对于脓毒症肝损伤的治疗有一定疗效，可以改善肝功能，降低炎症因子水平[3]。炎症因子分泌及炎症通路的激活直接参与了肝损伤的发生和进展，减轻炎症反应有助于改善肝细胞功能[4]。临床辨证使用江苏省名老中医周光主任经验方清肝凉血解毒汤治疗脓毒症肝损伤患者，有一定的疗效。本研究制备清肝凉血解毒汤含药血清，通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的L-02肝细胞损伤模型，探讨清肝凉血解毒汤含药血清对炎症损伤的改善作用及对JAK2/STAT3信号通路的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与细胞：SD级雄性大鼠8只，购自江苏药康生物有限公司，实验动物生产许可证号:SYXK(苏)2022-0004，饲养于南通大学动物实验中心，进食配制基础饲料。实验用L-02肝细胞由南通市肝病研究所提供。

1.1.2 药物及试剂：清肝凉血解毒汤药物购自三越中药有限公司，具体药物组成：生地黄、茵陈各30 g，牡丹皮、生黄芩、玄参各20 g，赤芍、柴胡各12 g，金银花15 g，连翘、栀子各10 g，黄连3 g。由南通市中医院制剂室煎制。CCK-8试剂盒(日本同仁，批号：SJ626)；凋亡试剂盒(BD公司，批号：9283373)，LPS(Sigma公司，批号：L2630)，RNAiso Plus(Takara公司，批号：9105)，Prime Script RT Master Mix反转录试剂盒(Takara公司，批号：9108)，SYBR Green Master Mix试剂盒(南京诺唯赞公司，批号：R233-01)，BCA蛋白测定试剂盒(碧云天公司，批号：P00006)，p-JAK2(批号：ab32101)、p-STAT3(批号：ab76315)、β-actin抗体(批号：ab8226)，二抗(批号：ab6728)，均购自Abcam公司。IL-6(批号：111504873)、TNF-α(批号：111412179)引物购自上海生工。IL-6-F：5’-AATGAGGAGACTTGCCTGGT-3’，IL-6-R：5’-GCAGGACTGGATCAGGACT-3’；TNF-α-F：5’-CCCGAGTGACAAGAATGTAG-3’，TNF-α-R：5’-TGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3’；GAPDH-F：5’-CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC-3’，GAPDH-R：5’-ATGAAGTCAGAGGAGACCACCTG-3’。

1.1.3 实验仪器：实时荧光定量PCR仪器(美国Bio-rad公司)，流式细胞仪(美国BD公司)，RT-1510酶标仪(美国Thermo Fisher公司)，紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 清肝凉血解毒汤含药血清制备：清肝凉血解毒汤方药煎煮，水煎浓缩药液含生药量0.4 g/ml。8只SD级雄性大鼠随机分为空白组和给药组，适应性饲养7 d后，开始灌胃，制备含药血清。据人鼠体表面积换算，给药组给药剂量为1 ml/100 g，每天灌胃2次，空白组给予相同剂量的0.9%氯化钠注射液，连续5 d。最后一次灌胃2 h后，以3%戊巴比妥麻醉大鼠，心脏取血，分离血清，-20 ℃保存备用。

1.2.2 细胞分组及培养：L-02肝细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。对数期细胞贴壁培养24 h后，分为五组：空白组(加入含10%空白组大鼠血清的培养基)，模型组(在空白组基础上同时加入LPS)，清肝凉血解毒汤低、中、高剂量组则加入LPS和清肝凉血解毒汤含药血清(1.25%、2.50%、5.00%)。

1.2.3 清肝凉血解毒汤对细胞增殖活力的影响：对数期生长的细胞种植于96孔板，每孔种植约8000细胞，细胞贴壁24 h后，弃去原培养基，更换含有1.25%、2.50%、5.00%、10.00%清肝凉血解毒汤含药血清的培养基，同时设置空白对照孔，设置复孔，置于培养箱中培养，根据细胞活力选择最佳的实验清肝凉血解毒汤含药血清浓度。

1.2.4 LPS诱导L-02肝细胞损伤模型：对数期生长的细胞种植于96孔板，每孔种植约8000细胞，细胞贴壁24 h后，弃去原培养基，模型组更换含有10、20、40、80 μg/ml LPS的培养基，同时设置空白对照组，设置复孔，置于培养箱中培养，根据细胞活力选择最佳实验LPS浓度。

1.2.5 CCK-8检测细胞增殖：将细胞按8000个/孔种植于96孔细胞培养板中，贴壁后更换不同浓度含药血清培养(或不同浓度LPS培养基)，按照试剂盒说明书检测各组细胞0、24、48、72 h的OD 450值。

1.2.6 流式实验检测细胞凋亡：L-02细胞贴壁后，加入不同浓度(1.25%、2.50%、5.00%)含药血清，培养48 h，收集死细胞及贴壁细胞，根据说明书依次在细胞中加入PE Annexin V 和7-AAD 试剂，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7 RT-PCR实验检测炎症因子：收集细胞，用RNAiso试剂按照说明提取细胞总RNA，通过逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，进行PCR定量检测白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达。GAPDH为内参，Power=2-△△Ct值计算相对表达量，采用Power 值行统计学分析。

1.2.8 Western blot实验检测p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平：提取各组细胞总蛋白，测定蛋白浓度，140 V电泳，转移蛋白至NC膜，牛奶封闭2 h，4 ℃一抗过夜孵育，二抗室温孵育1 h，室温洗膜3次，β-actin做内参，显影仪进行显影。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计数资料用百分比表示，采用卡方检验；正态分布计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 LPS对细胞增殖活力的影响 见表1。不同浓度LPS刺激L-02细胞12、24、48 h后，细胞活力随着LPS作用时间的延长、浓度的增加而逐渐下降。当LPS浓度为20 μg/ml，时间为24 h时，细胞存活率下降明显(P<0.05)。最终选择20 μg/ml LPS浓度24 h进行细胞实验。

表1 不同浓度LPS干预L-02细胞活力的影响(%)

2.2 不同浓度清肝凉血解毒汤含药血清对细胞增殖活力的影响 见表2。与空白对照组比较，1.25%、2.50%、5.00%含药血清组细胞在培养24 h后，存活率无明显改变，10.00%含药血清组细胞存活率下降(P<0.05)。因此后续选择1.25%、2.50%、5.00%含药血清进行后续实验，依次设为清肝凉血解毒汤低、中、高剂量组。

表2 不同浓度含药血清对L-02细胞活力的影响(%)

2.3 不同浓度清肝凉血解毒汤含药血清对细胞凋亡的影响 见表3(图1)。与空白组比较，加入LPS后的模型组L-02细胞凋亡明显增加；而清肝凉血解毒汤低剂量组细胞凋亡无显著下降，清肝凉血解毒汤中剂量、高剂量组细胞凋亡率较模型组显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组细胞凋亡率比较(%)

A：空白组；B：模型组；C：清肝凉血解毒汤低剂量组；D：清肝凉血解毒汤中剂量组；E：清肝凉血解毒汤高剂量组

2.4 各组IL-6、TNF-α mRNA表达水平比较 见表4。24 h后，与空白组相比，模型组IL-6、TNF-α表达量明显升高。与模型组相比，清肝凉血解毒汤中剂量及高剂量组IL-6、TNF-α表达量下降(P<0.05)，而清肝凉血解毒汤低剂量组表达量下降不明显，这表明中剂量、高剂量清肝凉血解毒汤含药血清可有效降低IL-6、TNF-α mRNA水平。

表4 各组IL-6、TNF-α mRNA表达水平比较

2.5 各组 p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平比较 见表5(图2)。结果表明，模型组p-JAK2和p-STAT3蛋白表达量均显著升高，经过清肝凉血解毒汤含药血清作用后，p-JAK2和p-STAT3表达下降，中剂量、高剂量清肝凉血解毒汤可明显抑制p-JAK2表达，低、中、高剂量清肝凉血解毒汤均可抑制p-STAT3表达，蛋白表达与含药血清浓度成正比(P<0.05)。

表5 各组 p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平比较

A：空白组；B：模型组；C：清肝凉血解毒汤低剂量组；D：清肝凉血解毒汤中剂量组；E：清肝凉血解毒汤高剂量组

3 讨 论

炎性细胞过度激活并释放大量炎性因子是脓毒症发生发展的重要机制之一，而释放的炎症因子广泛地参与了脓毒症肝损伤[5]。清肝凉血解毒汤为临床经验方，是否有肝细胞的保护作用，临床研究较少。本研究初步探讨了清肝凉血解毒汤含药血清通过JAK2/STAT3通路，减少炎性因子的释放，减少肝细胞凋亡，从而缓解脓毒症肝损伤的程度，旨在完善清肝凉血解毒汤在脏器保护中的作用，以期为临床治疗脓毒症肝损伤提供新的思路。

肝细胞内含有TNF-α受体，对TNF-α敏感，因为TNF-α是较早合成的炎性因子，直接导致肝细胞的损伤，同时促进了其他炎症因子的分泌释放[6]。研究发现，白细胞介素和TNF-α在导致肝脏细胞损伤和炎症的发生发展中具有协同作用[7]，形成级联效应，导致过度炎症。炎症因子IL-6和TNF-α可以有效激活STAT3信号通路，来调节炎症因子的分泌[8]。STAT3蛋白作为主要的炎症介质之一，其活化和多种疾病密切关联，如肿瘤[9]、衰老性疾病[10]、脓毒症[11]等。肝细胞凋亡是造成肝脏损伤的重要环节，在脓毒症肝损伤的发生发展中具有重要作用。中药单体槲皮素被发现可以抑制高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达，抑制其核外易位，从而减少肝细胞氧化应激和细胞凋亡的发生，从而减轻急性肝损伤大鼠的肝损伤[12]。

清肝凉血解毒汤可由犀角地黄汤、黄连解毒汤加减而成，是周老师的临床经验用方。研究显示，犀角地黄汤[13]，黄连解毒汤[14]对肝损伤均有较好的治疗作用，两方均能降低IL-6、TNF-α等因子的水平，改善患者的症状[15]，这与本研究结果一致，提示清热解毒类中药方剂的配伍使用，可以降低炎症反应。降低炎症因子分泌的有效成分可能涉及方内的多种中药以及多种单体成分，其有效成分均发现有减轻炎症反应以及治疗肝损伤的作用。陈琪等[16]研究发现，地黄的水提物可以减轻雷公藤甲素所致小鼠肝脏氧化应激损伤，可以增强肝细胞启动NF-E2相关因子2(Nrf2)表达，增加下游还原型辅酶/醌氧化还原酶1(NQO1)的表达。于德清[17]研究发现，牡丹皮提纯得到的有效成分丹皮酚、槲皮素、β-谷甾醇和没食子酸，可以通过激活Nrf2/Keap1通路抑制氧化应激。四种有效成分都具有抗氧化和保肝作用，丹皮酚体内单独给药的效果更强。茵陈的水提物，对肝损伤小鼠也有保护作用，可以降低小鼠血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)，肝组织中丙二醛(MDA)、活性氧自由基(ROS)的含量及转录激活因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的蛋白表达，提升肝组织中锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性，从而改善氧化应激损伤[18]。清肝凉血解毒汤含有多种有效单体，正是复杂的单体抗炎作用，才使本方有较好的抗炎效果。而肝损伤及炎症通路有很多[19]，JAK2/STAT3是经典的炎症通路[20]，研究显示中药多种有效成分均可以通过JAK2/STAT3通路来改善肝损伤。胡黄连苷Ⅱ可以降低急性胰腺炎诱导的肝损伤大鼠肝组织的氧化应激因子和炎症因子分泌，影响JAK2/STAT3信号通路的磷酸化[21]。而单体黄芩苷可以通过调节JAK2/STAT3信号通路来改善三氧化二坤诱导的肝损伤[22]。基于上述通路研究结果，本课题组也进行了通路研究，且实验结果与之相符，发现复方用药可以抑制JAK2/STAT3的激活。

本研究发现，清肝凉血解毒汤含药血清可以降低LPS引起的肝细胞凋亡，减少IL-6、TNF-α的分泌，抑制p-JAK2和p-STAT3表达，且药效以中、高剂量含药血清作用更好。