软枣猕猴桃发酵酒酶解工艺优化及指标分析

刘宇欣，王梦泽，温福田，关秀玲，N.V.斯克里普琴科，丁玉萍*，刘德江*

（1.佳木斯大学生物与农业学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.中-乌农林技术开发与应用国际合作联合实验室，黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯市检验检测中心，黑龙江 佳木斯 154004；4.乌克兰国家科学院M.M.格里什科国家植物园，乌克兰 基辅 01014）

软枣猕猴桃 [Actinidia arguta（Sieb.&Zucc）Planch.exMiq.]也被称为软枣子，是属于猕猴桃科、猕猴桃属的一类藤本植物。软枣猕猴桃含有维生素C、维生素B8、类胡萝卜素，赖氨酸、异亮氨酸等人体必需8种氨基酸[1-4]。此外，软枣猕猴桃还含有黄酮类、多糖、多酚、萜类、皂苷、生物碱等活性成分[5-9]。但软枣猕猴桃果胶含量较多[10]、出汁较少，因此，在制作果酒时，需要添加果胶酶进行酶解，以提高出酒率。由于维生素C是一种对光、热极其敏感的一种水溶性维生素[11]，酶解过程中酶解温度及酶解时间会影响软枣猕猴桃酒中维生素C的含量。本试验通过对软枣猕猴桃酒酶解工艺的优化，探究其对出酒率及理化指标的影响，以提高软枣猕猴桃出汁率，降低维生素C损失。本文可为软枣猕猴桃果酒酿造工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

软枣猕猴桃：佳木斯大学农林试验实习基地；白砂糖：市售；浆果果胶酶（≥21 000 μ/mL）：沧州夏盛生物技术有限公司；帝伯仕酵母：烟台帝伯仕酵母有限公司；拉曼德酵母：法国拉曼德公司；葡萄糖、酒石酸钾钠：天津市北方天医化学试剂厂；3，5-二硝基水杨酸：湖州市菱湖望菱试剂厂；NaOH、磷酸：天津市凯通化学试剂有限公司；亚硫酸钠：辽宁永强医药器械化玻有限公司；苯酚、草酸、碱性品红：天津市瑞金特化学品有限公司；高锰酸钾：沈阳市华东试剂厂；硫酸：天津市赢达稀贵化学试剂厂；盐酸：哈尔滨新春化工有限公司；试验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2004电子天平：诸暨市超泽衡器设备有限公司；YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌锅、101-1A电热恒温鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SPX-250B-Z型恒温培养箱：黑龙江东拓仪器制造有限公司；UV-8000紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；VS-840标准型净化工作台：上海跃进医疗器械厂；YL288-0-100酒精计：沈阳市卫工玻璃计器厂；2W阿贝折光仪：上海光学仪器有限公司；Y91S榨汁机：九阳股份有限公司。

1.3 工艺流程

1.4 操作要点

1.4.1 选果及处理

挑选无霉变、破损的软枣猕猴桃果实，清洗、控干、破碎。

1.4.2 果胶酶酶解

软枣猕猴桃与纯净水按1∶1（g/mL）混合均匀，加入果胶酶，保温酶解。

1.4.3 调整糖分

酶解后的果浆中加入一定量的白砂糖，使可溶固形物浓度为200 g/L。

1.4.4 发酵

每升发酵液接入0.03%酵母，于25℃发酵至恒重。

1.4.5 离心过滤

将发酵完毕的酒于4 000 r/min、离心10 min后过滤得软枣猕猴桃发酵原酒。

1.5 单因素试验

1.5.1 果胶酶添加量

将果胶酶添加量作为单一变量，分别添加果胶酶浓度 0%、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%，于 50℃酶解2 h，接入酵母发酵至恒重，进行指标测定。

1.5.2 酶解温度

固定果胶酶添加量为0.010%、酶解时间为2 h，设定酶解温度分别为室温[（24±1）℃]、40、50、60、70℃，其余步骤同1.5.1。

1.5.3 酶解时间

固定果胶酶添加量为0.010%、酶解温度为50℃，酶解时间为 0、1、2、3、4 h，其余步骤同 1.5.1。

1.6 正交试验

以果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度为因素，进行L9（33）三因素三水平正交试验。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.7 指标测定

酒精度采用蒸馏酒精度计法测定；总酸/挥发酸含量采用酸碱滴定法[12]测定；甲醇含量采用品红亚硫酸比色法[13]测定；还原糖含量采用3，5-二硝基水杨酸法[14]测定；总浸出物含量采用阿贝折光仪测定；维生素C含量采用紫外分光光度法[15-19]测定；总酯含量采用酸碱滴定法[20]测定；出酒率按以下公式计算。

按1.4.2进行酶解、离心，上清液即为软枣猕猴桃汁，出汁率按以下公式计算。

感官评价[21-23]：选出10名品鉴员（5男5女），分别对酒样的口感、澄清度、风味进行综合评分。取其平均值作为评分结果（满分100），感官评分标准见表2。

表2 软枣猕猴桃发酵酒感官评分标准Table 2 Sensory scoring standard for Actinidia arguta fermented wine

1.8 数据处理与分析

采用SPSS 20和Excel进行数据处理及分析，每个试验样做3次平行，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 果胶酶添加量对软枣猕猴桃发酵酒指标的影响

2.1.1 果胶酶添加量对出汁率、出酒率及维生素C含量的影响

不同果胶酶添加量对出汁率、出酒率、软枣猕猴桃发酵酒VC及软枣猕猴桃汁中VC含量的影响见图1。

图1 果胶酶添加量对出汁率、出酒率及维生素C含量的影响Fig.1 Effects of pectinase addition on juice yield，wine yield and vitamin C content

由图1可知，果胶酶添加量在0%～0.020%时，出汁率随果胶酶添加量增加而升高，果胶酶添加量0%，出汁率最低，为45.45%；果胶酶添加量0.020%，出汁率最高，为49.83%；最高值与最低值相差4.38%；当果胶酶添加量＞0.010%，出汁率增加不明显。出酒率随果胶酶增加先上升后降低；果胶酶添加量0%，出酒率最低，为37.00%；果胶酶添加量为0.010%时，出酒率最高，为42.67%；最高值与最低值相差5.67%。

果胶酶添加量对软枣猕猴桃汁及发酵酒中维生素C含量影响较小，软枣猕猴桃发酵酒VC含量均低于软枣猕猴桃汁中维生素C含量。当果胶酶添加量在0%～0.010%时，软枣猕猴猴桃汁中维生素C含量略有上升；当果胶酶添加量在0.010%～0.020%时，维生素C含量稍有下降；果胶酶添加量0.010%，软枣猕猴桃汁中维生素C含量最高，为430 mg/L；软枣猕猴桃发酵酒VC含量在果胶酶添加量0.005%～0.015%时，逐渐上升，果胶酶添加量为0.020%，维生素C含量下降；果胶酶添加量为0.005%，软枣猕猴桃发酵酒VC含量最低，为246.69 mg/L，果胶酶添加量为0.015%，软枣猕猴桃发酵酒VC含量最高，为311.49 mg/L，最高值与最低值相差64.80 mg/L。综合考虑出酒率及维生素C含量，选定果胶酶添加量为0.010%。

2.1.2 果胶酶添加量对软枣猕猴桃酒指标的影响

果胶酶添加量对软枣猕猴桃酒酒精度、还原糖、总酯含量等指标的影响如表3所示。

表3 果胶酶添加量对软枣猕猴桃发酵酒理化指标的影响Table 3 Effects of pectinase addition on physical and chemical indexes of Actinidia arguta fermented wine

由表3可知，酒精度随果胶酶添加量增加逐渐增加。果胶酶添加量为0.020%，酒精度最高，为7.60%vol，比最低值高0.8%vol。总浸出物含量随果胶酶添加量增加而增加，果胶酶添加量0.020%，总浸出物含量最高，为3.43 g/L。总酸含量随果胶酶添加量增加先升高后降低，果胶酶添加量在0%～0.010%时，总酸含量逐渐上升。果胶酶添加量0.010%，总酸含量最高，为7.17g/L。当果胶酶添加量＞0.010%，总酸含量逐渐下降，果胶酶添加量在0.020%，总酸含量最低，为6.64 g/L。甲醇含量随着果胶酶添加量增加逐渐升高，5组酒样中，果胶酶添加量0%，甲醇含量最低，为110.79 mg/L；果胶酶添加量0.020%，甲醇含量最高，为218.98mg/L；GB5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》规定：果酒甲醇≤400mg/L，因此，5组酒样均符合国家标准。随着果胶酶添加量增加，甲醇升高的原因是果胶酶添加量越大，果胶质分解越多，发酵生成甲醇量越多。总酯含量随果胶酶添加量增加先升高后降低。果胶酶添加量0.02%时，总酯含量最低，为0.50 g/L；最高值和最低值相差0.45 g/L。感官评分随果胶酶添加量增加先升高后降低。果胶酶添加量0%时，感官评分最低，为75.00。果胶酶添加量为0.010%时，感官评分最高，为89.00。不添加果胶酶时，酒口感厚重黏稠，感官评分最低，果胶酶添加量为0.010%时，酒口感清爽适口，感官评分最高；添加果胶酶过多会给酒带入异杂味，影响口感。

2.2 酶解温度对软枣猕猴桃发酵酒指标的影响

2.2.1 酶解温度对出汁率、出酒率及维生素C含量的影响

酶解温度对出汁率、出酒率、软枣猕猴桃发酵酒VC、软枣猕猴桃汁中VC含量的影响见图2。

图2 酶解温度对出汁率、出酒率及维生素C含量的影响Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on juice yield，wine yield and vitamin C content

由图2可知，酶解温度在室温[（24±1）℃]～70℃内，随温度上升，出汁率和出酒率均先升高后降低，酶解温度在室温～50℃时，出汁率、出酒率逐渐上升；酶解温度＞50℃时，出汁率、出酒率均逐渐降低。室温时，出汁率、出酒率最低，分别为37.34%、33.10%。酶解温度为50℃时；出汁率、出酒率最高，分别为45.37%、42.07%。出汁率最高值与最低值相差8.03%，出酒率最高值与最低值相差8.97%。

软枣猕猴猴桃汁及软枣猕猴桃发酵酒VC含量在酶解温度室温～70℃内，逐渐降低，但软枣猕猴猴桃发酵酒中的维生素C含量均低于软枣猕猴桃汁中VC的含量。室温下，汁及软枣猕猴桃发酵酒VC含量最高，分别为448.08、255.11 mg/L；70℃下，软枣猕猴桃汁及发酵酒VC含量最低，分别为360.76、150.28 mg/L；软枣猕猴桃汁中VC最高值与最低值相差87.32 mg/L，软枣猕猴桃发酵酒VC最高值与最低值相差104.83 mg/L。综合出酒率及维生素C含量选定酶解温度为50℃。

2.2.2 酶解温度对软枣猕猴桃酒指标的影响

酶解温度对软枣猕猴桃酒酒精度、还原糖、总酯含量等指标的影响如表4所示。

表4 酶解温度对软枣猕猴桃发酵酒理化指标的影响Table 4 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on physical and chemical indexes of Actinidia arguta fermented wine

由表4可知，总浸出物含量随酶解温度升高先增加后降低，酶解温度40℃时，总浸出物含量最高，为3.44g/L；酶解温度70℃，总浸出物含量最低，为3.40g/L；最高值与最低值相差0.04g/L。总酸含量随酶解温度升高，先增加后降低，酶解温度50℃，总酸含量最高，为7.17g/L；酶解温度70℃，总酸含量最低，为6.43g/L；最高值与最低值相差0.74g/L。甲醇含量随酶解温度上升先升高后降低，酶解温度＜60℃，甲醇含量随温度升高而升高，60℃，甲醇含量最高，为200.97 mg/L，酶解温度升高到70℃，甲醇含量降为197.32 mg/L。70℃时，酶解温度高，果胶酶酶活受到影响，分解果胶能力减弱，因此，甲醇含量降低。感官评分随酶解温度升高，先增加后降低，室温酶解时，酒口感、香气较差，感官评分最低，为76.00；酶解温度50℃，酒口感清爽柔和，感官评分最高，为88.00。

2.3 酶解时间对软枣猕猴桃发酵酒指标的影响

2.3.1 酶解时间对出酒率、出汁率及维生素C含量的影响

酶解时间对出汁率、出酒率、软枣猕猴桃发酵酒VC、软枣猕猴桃汁中VC含量的影响见图3。

图3 酶解时间对出汁率、出酒率及维生素C含量的影响Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis time on juice yield，wine yield and vitamin C content

由图3可知，出汁率、出酒率随酶解时间延长，呈先增加后降低的趋势。酶解时间为0 h时，出汁率、出酒率最低，分别为38.64%、36.91%；酶解时间2 h，出汁率、出酒率最高，分别为53.42%、43.92%；出汁率最高值与最低值相差14.78%，出酒率最高值相较最低值差7.01%。酶解时间3 h～4 h，出酒率逐渐降低；酶解时间4 h，出酒率为38.61%，略高于空白组。

软枣猕猴桃汁及软枣猕猴桃发酵酒VC含量随酶解时间延长均逐渐下降，但软枣猕猴桃汁中VC含量均高于软枣猕猴桃发酵酒VC含量。酶解时间0 h，软枣猕猴桃汁及软枣猕猴桃发酵酒VC含量最高，分别为 447.26、256.31 mg/L；酶解时间 4 h，软枣猕猴桃汁及软枣猕猴桃发酵酒VC含量最低，分别为359.94、217.02 mg/L；软枣猕猴桃汁中VC含量最高值比最低值高87.32 mg/L；软枣猕猴桃发酵酒VC含量最高值比最低值高39.29 mg/L。综合出酒率及维生素C含量选定最适酶解时间为2 h。

2.3.2 酶解时间对软枣猕猴桃酒指标的影响

酶解时间对软枣猕猴桃酒酒精度、还原糖、总酯含量等指标的影响如表5所示。

表5 酶解时间对软枣猕猴桃发酵酒理化指标的影响Table 5 Effects of enzymatic hydrolysis time on physical and chemical indexes of Actinidia arguta fermented wine

由表5可知，酒精度随酶解时间延长，先升高后降低，酶解时间2 h，酒精度最高，为8.00%vol，最高值比最低值高0.33%vol。总浸出物含量随酶解时间延长逐渐增加，酶解时间4h，总浸出物含量最高，为3.51g/L；最高值比最低值高0.33 g/L。挥发酸含量随酶解时间延长逐渐降低，但相差不大。甲醇含量随酶解时间延长逐渐增加，酶解时间0 h，甲醇含量最低，为130.50 mg/L；酶解时间4 h，甲醇含量最高，为198.79 mg/L；最高值比最低值高68.29 mg/L。甲醇含量在0～2 h时，增加幅度较大，酶解时间超过2 h，甲醇含量上升幅度较小。感官评分随酶解时间延长先升高后降低，酶解时间2h，酒香浓郁、口感清爽，感官评价最高，评分为89.00；酶解时间0 h，酒样果香较浓，但口感较为黏稠，感官评价最低，评分为77.00。

2.4 正交试验结果分析

在单因素试验的基础上，以果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度为因素，进行三因素三水平正交试验，以出酒率作为考察指标，正交试验结果与分析见表6～表7。

表6 正交试验结果Table 6 Results of orthogonal test

表7 基于出酒率的正交试验结果方差分析Table 7 Analysis of variance of orthogonal test results based on wine yield

由极差分析可知，各因素对出酒率影响的主次为B＞A＞C，即，对出酒率的影响酶解温度是主要影响因素，果胶酶添加量是次要影响因素，酶解时间影响最小；由方差分析可知，果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间对软枣猕猴桃果酒出酒率均有极显著影响（P＜0.01）。R2=0.923，R2adj=0.917，分析 K 值得出酶解工艺优化组合为A2B3C1；直接观察9组试验中出酒率最高的组合为A2B3C2。

2.5 对比试验结果分析

将正交试验结果得出最佳优化组合及直接观察最佳组合进行对比试验，结果为试验组A2B3C2软枣猕猴桃浆出酒率为48.46%，正交优化组A2B3C1软枣猕猴桃浆出酒率为49.38%，结果优于试验组。即软枣猕猴桃酒最优酶解工艺为果胶酶添加量0.010%、酶解温度55℃、酶解1 h，此工艺下发酵的软枣猕猴桃酒维生素C含量为297.27 mg/L、酒精度7.50%vol、还原糖含量2.09 g/L、总浸出物含量3.50 g/L、甲醇含量172.10 mg/L。

3 结论

通过单因素试验探究果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度对软枣猕猴桃发酵酒出酒率及维生素C含量的影响。果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度对出酒率和维生素C含量均有极显著影响（P＜0.01）。出酒率随着酶添加量增加、酶解时间延长、酶解温度升高而增加，但酶解时间过长，酶解温度过高，酶活降低，不利于提高出酒率。维生素C含量受酶解温度和酶解时间影响较大，随酶解温度升高和酶解时间延长维生素C含量呈负增长。以出酒率为评价指标，通过正交试验优化软枣猕猴桃发酵酒最佳果胶酶酶解工艺：果胶酶添加量为0.010%、酶解温度55℃、酶解时间1 h，发酵软枣猕猴桃酒的出酒率49.38%、维生素C含量297.27 mg/L、酒精度 7.50%vol、还原糖含量 2.09 g/L、总浸出物含量3.50 g/L、甲醇含量172.10 mg/L，采用此酶解工艺酿制的软枣猕猴桃酒口味清爽利口、色泽鲜亮、酸度适中、果香酒香协调、适口性好，出酒率高。